在分子生物学研究中,DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等(1977)发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和 Gilbert(1977)发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大,但都是根据核苷酸在某一固定的点开始,随机在某一个特定的碱基处终止,产生A,T,C,G四组不同长度的一系列核苷酸,然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测,从而获得DNA序列。目前Sanger测序法得到了广泛的应用。 Sanger 法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成,每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP),并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团,使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整,使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点,但终止在不同的的核苷酸上,可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段,凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。 第一节 非同位素银染测序系统操作技术 一、概述: Promega公司的SILVER SEQUENCETM DNA测序系统是一种无放射性的序列分析系统,它通过灵敏的银染方法检测凝胶中的条带。 银染提供了一种对于放射性或荧光法来说更加快速,廉价的替代方法。测序结果可以在同一天内得到;电泳完成后经90分钟就可读序,这是常规的放射性测序法做不到的。此外, SILVER SEQUENCETM系统用未修饰的5'OH寡聚核苷酸作为引物, 减少了特殊修饰寡聚核苷酸的花费。该系统不需要放射性方法中对同位素的谨慎操作,也不需要荧光法或化学发光技术的昂贵试剂。另外,也不需要象大多数荧光法那样用仪器来检测序列条带。 Taq DNA聚合酶在95℃时极强的热稳定性。本系统利用的测序级Taq DNA聚合酶是一种Taq DNA聚合酶的修饰产品,对于双链DNA模板有非常好的效果,具有高度的准确性,能产生均一的条带,且背景低。 SILVER SEQUENCETM系统包含被修饰的核苷酸混合物,如7-去氮dGTP(7-deaza dGTP,或dITP)替代dGTP可清除由GC丰富区域所引起的条带压缩现象。 退火温度是热循环测序中最重要的因素。高退火温度可减少模板二级结构。提高引物结合模板配对的严谨性。链重退火和模板二级结构则限制了小片断PCR产物(<500bp)得到清楚的序列数据的能力。引物延伸起始于每个循环的退火阶段。在较低温度时,聚合酶可能会遇到坚固的二级结构区域,它可导致聚合酶解离。则在四个电泳道中均有同一相对位置的条带。因为这些原因,应该使用尽可能高的退火温度。对于有牢固二级结构的模板建议使用95℃变性、70℃退火/延伸的循环模式。一般来说,较长的引物及GC含量高的引物能得到较强的信号。实验结果表明,>24mer的GC含量约为50%的引物可得到最佳结果。 由于本系统采用热循环装置, 与常规的测序方法相比具有如下几点好处:(1).本方法线性扩增模板DNA产生足够的产物使银染技术能够检测序列条带,测序反应需要0.03--2pmol模板DNA, 随模板种类而定。(2). 在每一个变性循环中的高温可以取代对双链DNA(dsDNA)模板的碱变性及乙醇沉淀过程,变性循环也有助于消除由于线性dsDNA模板(如PCR反应产物)快速重退火所引起的问题。(3). 高温聚合酶反应减弱了DNA模板的二级结构,允许聚合酶穿过高度二级结构化的区域。 二、材料 待测已提纯的DNA,可为单链,也可为双链。 三、设备 高压电泳仪,测序用电泳槽,制胶设备,PCR仪。 |
四、试剂 (1)SILVER SEQUENCETM DNA测序试剂盒。 五、操作步骤: 成功地使用银染测序系统需要对提供的操作方法进行仔细考虑。银染不如放射性检测法灵敏,而需要更多的模板量,此外,也不可能通过延长X-光胶片曝光时间的方法增加信号强度。因此,请使用推荐的DNA模板量, 每次均使用所提供的对照检查系统的可靠性,并且注意如下几点: (1) DNA的浓度和纯度必须经过琼脂糖凝胶电泳或荧光法测定, 样品应与已知量DNA一起电泳。 (一)测序反应: 1. 对于每组测序反应,标记四个0.5ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml适当的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(约20ml)矿物油,盖上盖子保存于冰上或4℃备用。 (2)对照反应 [注意] 1、测序所用模板DNA的量一般按下面要求加入: 模板种类/长度 模板量 2、计算与4.5pmol相当的引物纳克数可用以下一般公式: 3、为阻止Taq DNA聚合酶延伸非特异性退火引物, 热循环仪必须预热至95℃。温度变换应越快越好。下面的循环时间不包括变温时间。如果你无法确定使用何种模式,建议从模式1开始。 |
(二)、 测序凝胶板的制备 1、玻璃板的处理: 银染测序的玻璃板一定要非常清洁,一般先用温水和去污剂洗涤,再用去离子水冲洗玻璃板,除去残留的去污剂,最后用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遗留的去污剂微膜可能导致凝胶染色时背景偏高(棕色)。短玻璃板经粘合溶液处理可将凝胶化学交联于玻璃板上。这一步对于在银染操作过程中防止凝胶撕裂至关重要。 2、凝胶的制备: (1)玻璃板经粘合硅胶和Sigmacote处理后,即可固定玻璃板。该方法是用0.2mm或0.4mm厚的边条置于玻璃板左右两侧,将另一块玻璃板压于其上。在长玻璃板的一侧插入鲨鱼齿梳平的一面边缘,用夹子固定住。 (3)胶配制好后,即可灌制胶板。一般是将凝胶沿着压条边缘缓慢地倒入玻璃板的槽中,倒完后,静止放置使之聚合完全。 [注意] 1、使用夹子固定玻璃板时,最好夹子的力量稍大一些,防止因力量不足使灌胶的过程中出现漏胶液现象。 |
(三)电泳: 1、预电泳 2、样品的制备: 3、上样及电泳 [注意] (四)、 测序凝胶的银染 染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。因而至少使用两个盘子,大小与玻璃板类似。在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。 [注意] 测序产物的银染是显现序列信息的一种新方法,本系统的成败受几个因素的影响。 |
(五)、EDF胶片显影 [注意] 1. 进行EDF胶片显影之前凝胶必须完全干燥。戴手套进行操作, 以免印上指纹。同时注意EDF胶片不能用自动胶片处理器。 |
第二节 T7 DNA聚合酶测序技术 一、概述 T7 DNA聚合酶最初具有5'→3'聚合酶活性以及单链和双链3'→5'外切酶活性。当T7 DNA聚合酶用适当方法处理后,可使3'→5'外切酶活力明显下降。改造后的T7 DNA聚合酶又称T7测序酶。 用T7测序酶得到的测序数据具有在每个碱基位置都有相对均匀的配对参入。因此, 放射自显影所得到的结果较为清晰易辩, 对于许多模板来说, 使用含有dGTP的混合物即可得到理想的测序结果。然而, 如果出现了带压缩的问题,则用含dITP的混合物来取代常规的dGTP。dITP的掺入,使在富含GC的模板中也能有效地消除带压缩现象。 T7测序酶具有很高的聚合速度,并有高度的延续性,正因如此,该酶在使用中不同于Klenow片段和反转录酶。它几乎没有错误性的终止,整个反应在很短的时间内完成,并且不需要进行追加反应(Chase step)。 然而对于有紧密二级结构的区域, 错误的终止反应会给阅读序列带来困难。如果碰到这些情况,应使用一些高温DNA聚合酶,如Promega公司的测序级Taq DNA 酶。利用高温DNA聚合酶独有的耐热特性,测序反应可在不利于形成二级结构的高温条件下进行。 T7 DNA聚合酶测序的快速而简便的方法是从Klenow酶和AMV反转录酶测序的操作步骤修改而来的,它的最大优点是具有很高的5'-3'的DNA合成活性和极低的3'-5'端外切酶的活性。在测序过程中,若以同位素标记则相对于大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段Klenow,或反转录酶AMV而言,则可使条带非常的均一,并且它的放射性背景极低。 T7 DNA聚合酶测序时DNA的合成的过程是分二步完成的。第一步为标记反应阶段,第二步方为双脱氧链末端终止的DNA合成过程。在第一步过程中,引物的延伸是在较低浓度的脱氧三磷酸核苷酸的存在下完成的,在此反应过程中,已含有经放射性标记的dATP。第二步过程中,脱氧三磷酸核苷酸浓度提高,并且加入双脱氧的三磷酸核苷酸,DNA 在合成过程中,因加入的双脱氧三磷酸核苷酸而随机终止,形成长短不一的DNA片段。 二、材料 待测的DNA模板,可用双链或单链模板。 三、设备 高压电泳仪,测序用电泳槽,照相显影用大号塑料盆,制胶设备,吹风机,放射自显影盒,X-光片。 四、试剂 |
五、操作步骤: (一)、模板制备 1、M13单链模板制备:在转化入合适的大肠杆菌宿主菌且在含有指示剂如X-gal/IPTG的培养基上铺板之后,含有M13重组子的细胞将表现出无色的"噬菌斑",事实上受感染的细胞并非被噬菌体溶菌或杀死,出现噬菌斑是因为被感染的细菌在生长速度上比其周围未感染的细菌慢的缘故,从无色噬菌斑上得到的感染细胞经培养便能产生测序反应所需的单链模板。 2、噬粒(Phagemid)单链模板的制备: 噬粒是指含有丝状单链DNA噬菌体复制区的嵌合质粒。分子克隆中常用的pBluescript系列和pGEM系列的质粒均属噬粒。含重组噬粒的细胞单菌落经液体培养并用辅助噬菌体超感染后就能产生测序反应所需的单链DNA模板。 |
3、质粒膜板制备:参照第一章所述的方法。 (二)超螺旋质粒DNA的碱变性: (三)、测序反应: 1、引物和模板的退火: 2、标记反应 [注意] 1、稀释时应将所有的溶液预先混合完全后再加入酶液。 |
(四)测序凝胶板的制备及电泳 参考第一节测序凝胶板的制备及电泳部分。样品加热至75-80℃ 2分钟,立即上样,每个泳道的使用量为2-3ml 。 (五)测序凝胶板的干燥及放射自显影。 电泳完毕后,经32P或35S标记的产物可用对b-射线敏感的X-光胶片放射自显影检测。 [ 注意] 1、去除尿素是非常重要的,如果有残存的尿素,则在干胶过程中会使凝胶很粘,而无法进行放射自显影。可以用10%冰醋酸洗二次,第一次15分钟,第二次10分钟。如果胶浓度高于12%,则有可能在干胶过程中会产生皱纹,防止的方法有二种:(1)冰醋酸溶液中加入1%-2%的甘油;(2)不干燥胶,直接在冰箱中以冰冻状态曝光,应注意的是在使用这个方法时,要在凝胶和X-光片之间加一层薄的塑料薄膜。一般来说都使用第一种方法。 |
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