Ⅱ级生物安全柜在设计上不但能保护操作者和环境，而且能保护工作台面的物品不受房间空气的污染。Ⅱ级生物安全柜有四种不同类型（分别为A1、A2、B1和B2型），它们与I级生物安全柜的不同之处在于，只让经HEPA过滤的（无菌的）层流空气到达工作台面。Ⅱ级生物安全柜可用于一、二、三级生物安全实验室。在使用正压防护服的条件下，Ⅱ级生物安全柜也可用于四级生物安全实验室。

（1）Ⅱ级A型生物安全柜：Ⅱ级A1型生物安全柜内置风机将房间空气（供给空气）经前面的开口引入安全柜内并进入前面的进风格栅。在正面开口处的空气流人速度至少应该达0.38m/s。然后，供气先通过供风HEPA过滤器，再向下层流到工作台面。空气在向下流动到距工作台面大约6～18cm处分开，其中的一半会通过前面的排风格栅，而另一半则通过后面的排风格栅排出。所有在工作台面形成的气溶胶可立刻被这样向下的气流带走，并经两组排风格栅排出，从而为实验对象提供保护。气流接着通过后面的负压通风系统到达位于安全柜顶部介于供风和排风过滤器之间的空间。大约70%的空气将经过供风HEPA过滤器重新返回到生物安全柜内的操作区域，而剩余的30%则经过排风过滤器进入房间内或被排到外面。

Ⅱ级A1型生物安全柜排出的空气可以重新排入房间里，也可以通过连接到专用通风管道上的套管或通过建筑物的排风系统排到建筑物外面。二者相比，前者可减少能耗。

生物安全柜通过与排风系统的通风管道连接，还可用于挥发性放射性核素以及挥发性有毒化学品的操作。

（2）Ⅱ级A2型、Ⅱ级B1型、Ⅱ级B2型生堵安全柜：Ⅱ级A2型以及Ⅱ级B1型和Ⅱ级B2型生物安全柜都是由Ⅱ级A1型生物安全柜变化而来，这些不同类型的Ⅱ级生物安全柜。