注意:在准备做磷酸(酯)酶实验的时候,不加磷酸酯酶抑制剂
工作液配制:
配制100ml的modified RIPA buffe:
1. 称取790mg 的Tris-Base,加到75ml 去离子水中,加入900mg的NaCl,搅拌,直到全部溶解,用HCl调节PH值到7.4
2. 加10 ml 10%的NP-40
3. 加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠,搅拌,直到溶液澄清
4. 加1 ml 100mM的EDTA,用量筒定容到100ml,2-8℃保存
5. 理论上,蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入(抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂各100 μl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 μl),但是PMSF在水溶液中很不稳定,30分钟就会降解一半,所以PMSF应该在使用前现加,其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。
各种成分在工作液中的终浓度:
* Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4
* NP-40: 1%
* 去氧胆酸钠:0.25%
* NaCl: 150 mM
* EDTA: 1 mM
* PMSF: 1 mM
* 抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂: 各1 μg/ml
* Na3VO4: 1 mM
* NaF: 1 mM