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  免疫测定(immunoassay,IA)是应用免疫学技术测定标本的方法,其基本原理是抗原抗体的特异性识别。酶联免疫吸附试验 (enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是实验室比较常用的免疫检测方法。
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常见的免疫检测技术回目录

(一)皮内试验 (intrader rpmal test,ID) 宿主在病原体刺激后,体内产生亲细胞性抗体(IgE和IgG4)。当其与相应抗原结合后,肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒,释放生物活性物质,引起注射抗原的局部皮肤出现皮丘及红晕,以此便可判断体内是否某有种特异性抗体存在。
(二)免疫扩散(immunodiffusion)和免疫电泳(immunoelectrophoresis)
1.免疫扩散 于一定条件下,抗原与抗体在琼脂凝胶中相遇,在二者含量比例合适时形成肉眼可见的白色沉淀。本法有两种类型:①单相免疫扩散:将一定量的抗体混入琼脂凝胶中,使抗原溶液在凝胶中扩散而形成沉淀环,其大小与抗原量成正比;②双相免疫扩散:将抗原与抗体分别置于凝胶板的相对位置,二者可自由扩散并在中间形成沉淀线。用双相免疫扩散法既可用已知抗原检测未知抗体,也可用已知抗体检测未知抗原。
2.免疫电泳 是将免疫扩散与蛋白质凝胶电泳相结合的一项技术。事先将抗原在凝胶板中电泳,之后在凝胶槽中加入相应抗体,抗原和抗体双相扩散后,在比例合适的位置,产生肉眼可见的弧形沉淀线。
(三)间接红细胞凝集试验(indirect haemagglutination test,IHA) 以红细胞作为可溶性抗原的载体并使之致敏。致敏的红细胞与特异性抗体结合而产生凝集,抗原与抗体间的特异性反应即由此而显现。常用的红细胞为绵羊或O型人红细胞。
(四)间接荧光抗体试验 (indirect fluorescent antibody method,IFA)
vvv 本法用荧光素(异硫氰基荧光素)标记第二抗体,可以进行多种特异性抗原抗体反应,即可检测抗原又可检测抗体。本法具有较高的敏感性、特异性和重现性等优点,除可用于寄生虫病的快速诊断,流行病学调查和疫情监测外,还可用于组织切片中抗原定位以及在细胞和亚细胞水平观察和鉴定抗原、抗体和免疫复合物。
(五)对流免疫电流试验 (counter-immunoelectrophoresis,CIE) 对流免疫电泳试验是以琼脂或琼脂糖凝胶为基质的一种快速,敏感的电泳技术。既可用已知抗原检测抗体,又可用已知抗体检测抗原。反应结果可信度高,适用范围广。以本法为基础改进的技术有酶标记抗原对流免疫电泳(enzyme-linked antigen counterimmunoelectrophoresis,ELACIE )和放射对流免疫电泳自显影(radio-immuno-counterelectrophoretic autography,RCIEPA)等技术。二者克服了电泳技术本身不够灵敏的弱点。
(六)酶联免疫吸附试验 (enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)
vvv 酶联免疫吸附试验原理是将抗原或抗体与底物(酶)结合,使其保持免疫反应和酶的活性。把标记的抗原或抗体与包被于固相载体上的配体结合,再使之与相应的无色底物作用而显示颜色,根据显色深浅程度目测或用酶标仪测定OD值判定结果。
(七)免疫酶染色试验 (immunoenzyme staining test,IEST) 免疫酶染色试验以含寄生虫病原的组织切片、印片或培养物涂片为固相抗原,当其与待测标本中的特异性抗体结合后,可再与酶标记的第二抗体反应形成酶标记免疫复合物,后者可与酶的相应底物作用而出现肉眼或光镜下可见的呈色反应。
(八)免疫印迹试验(immunobloting technique,ELIB) 免疫印迹试验又称免疫印渍或western blot,是由十二烷基硫酸钠-聚丙烯酸胺凝胶电泳(SDS-PAGE),电转印及固相酶免疫试验三项技术结合为一体的一种特殊的分析检测技术。本法具有高度敏感性和特异性。

免疫酶检测技术回目录

(一) 原理 
免疫酶技术是近代发展起来的一项新的免疫技术。它是把抗原抗体的免疫学反应与酶的高效催化作用原理有机地结合起来,即把具有催化活性的酶类通过化学的方法和抗体(或抗原)结合起来成为酶标记物。这种酶标记物同时具有免疫学反应性和化学反应性,将其与待测的抗原或抗体结合,通过酶的活性降解底物呈现出颜色反应从而显示出该免疫学反应的存在。酶的活性与底物以及与显色反应呈一定的比例关系。显色越深,说明酶降解底物量越大,与酶标抗体(抗原)相检测对应的抗原(或抗体)量也就越多。
(二)免疫酶的分类与特点
1.分类 
2.免疫酶技术的特点
⑴ 灵敏度高,可与放射免疫相比,检测能力可达ng水平。
⑵ 应用范围广,既能检测抗体又能检测抗原,既能定性又能定量、定位及抗原分析。
免疫荧光技术、放射免疫技术和免疫酶技术的应用比较见表12-1
表12-1免疫酶技术、免疫荧光和放射免疫技术的比较
 定性 定量 定位 抗原分析
免疫荧光技术 + - + -
免疫酶技术 + + + +
放射免疫技术 + + + -
⑶ 不需要特殊设备,放射免疫需要特殊的实验室条件,免疫荧光法需要荧光显微镜。
⑷ 标本可长期保存。
⑸ 酶标记物有效时间较长,一般低温保存可达一年以上。
(三)常用标记酶及其底物
1.标记酶的选择条件
⑴ 活性高,分解底物的能力强。
⑵ 特异性强,即作用于底物的专一性强。
⑶ 与抗原抗体结合后仍保持酶的活性。
⑷ 与底物作用可以显色。
⑸ 纯度高、易纯化,即含杂蛋白少。
⑹ 可溶性(水溶性)好,在溶液中稳定。
⑺ 测定方法简单。
⑻ 酶来源方便、价格低廉。
2.符合条件的酶
⑴ 辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase HRP),分子量40 000。
⑵ 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase AKP),分子量82 000。
⑶ β-半乳糖甙酶(β-galactosidase),分子量540 000。
⑷ 葡萄糖氧化酶(glucose oxidase),分子量186 000。
其中以HRP最为常用,因其具有活力高、稳定、分子量小、易提纯等优点。
3.辣根过氧化物酶  HRP广泛地分布于植物界,以辣根中含量最高。它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉辅基组成的一种糖蛋白,含糖量18%,它由300个氨基酸和4个二硫键连接而成。分子量40 000,等电点5.5~9.0之间,它催化的最适pH因供氢体不同而有所差异,但多在pH5.0左右。HRP易溶于水和58%以下的饱和硫酸铵溶液。
HRP酶蛋白和其它杂蛋白的最大吸收光谱为275nm,辅基部分的最大吸收光谱为403nm,二者比值OD403/OD275为酶的纯度。以RZ值(Reinheit Zabl德文)表示。RZ>3为高质量,RZ>2.5为中等质量,RZ<2.5则需要纯化。RZ值越小,表示杂蛋白越多,如RZ为0.6,则表示有75%的杂蛋白。
衡量酶质量的标准有两条,一个是纯度即RZ值,一个是活力。只用酶的纯度表示是不全面的。目前国际上规定,酶的活力以国际单位表示。一个酶单位是在一定的条件下(pH、温度和底物浓度)一分钟能降解1mMol/L底物的酶活力。1mg酶所含有酶的单位数称为比活性。用比活性进行酶的比较。
用作标记的过氧化物酶活性一般要大于250units/mg。
4.HRP的作用底物与供氢体  底物为H2O2,催化时需供氢体。
⑴ 组化法常用的供氢体是3,3′-二氨基联苯胺盐酸盐(3.3-diamino-benzidine . DAB)。其反应物由于形成的氧化型中间体迅速聚合,形成不溶性的棕色吩嗪衍生物,可用于光学显微镜观察。这种多聚物能还原和螯合四氧化锇(OSO4)形成具有电子密度的产物,可适用于电子显微镜观察。
⑵ 用于ELISA的供氢体有下列数种。
表  ELISA的供氢体
供  氢  体 反应颜色 波长 终止剂 终止
颜色 测定波长
联大茴香胺(OD) 桔红 512 5Mol/L HCI 黄 400
邻苯二胺(OPD) 黄 444 2Mol/L H2SO4 桔黄 492
邻苯甲苯胺(OT) 兰 636 2Mol/L H2SO4 黄 442
5-氨基水杨酸 褐 475 1Mol/L NaOH 褐 449
以OD和OPD最为常用。OPD有致癌作用,使用时需注意。
5.碱性磷酸酶  可从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取。它是一种磷酸脂酶,其作用是催化磷酸-脂水解释放出无机磷酸而显色。或者通过水解产生的磷酸与钼酸反应生成磷钼酸,然后在还原剂作用下生成蓝色的产物进行测定。

D 酶标记抗体的制备
(一)酶标抗体的条件
1.纯度高、含杂蛋白少,用IgG优于血清抗体,用Fab优于IgG。
2.特异性强 即抗IgG与IgG在免疫电泳上只有一条沉淀线,与IgG的全血清也只有一条沉淀线,这才算是特异性的单价抗体。
3.效价高 一般琼脂扩散鉴定为1︰64以上才算合格。
(二)酶标记方法
1.交联法  交联法通常用的交联剂是戊二醛,戊二醛商品大多为25%的水溶液,利用戊二醛分子上对称的两个醛基,分别与酶和蛋白质分子中游离的氨基、酚基等以共价键结合而进行标记。标记时应尽量采用新鲜纯品,当戌二醛的OD235nm/OD280nm<3时,即为好的交联剂。
戊二醛交联法又分为一步法和二步法。
⑴ 一步法:即把酶、戊二醛和抗体一起加入进行交联。然后透析出过量的戊二醛而制备出具有高分子量的酶结合物。由于抗体分子量大(16万),酶分子量小(4万),抗体分子的氨基数比酶蛋白分子氨基数多得多,结果生成的抗体-戊二醛或抗体-戊二醛-抗体多而造成酶标物的活性小。一步法操作:①抗IgG-AKP的制备:将10mgAKP溶于含有5mg抗IgG的1mlPBS(0.01Mol/L pH7.0)中,在冰浴中缓缓搅拌,尽量避免气泡产生,完全溶解后,缓缓滴加1%戊二醛溶液4ml,使戊二醛的最终浓度为0.2%,移至室温中静置2h~3h后,以0.01Mol/L pH7.0 PBS液4℃充分透析或以SephadexG25柱除去过量的戊二醛,4℃保存备用(也可保存于50%甘油中置低温冰箱);②抗IgG-HRP的制备:将12mgHRP溶于含5mg抗IgG的1mlPBS(0.1Mol/L pH6.8)中,缓慢搅拌下加入1%戊二醛溶液4mL,置室温2h~3h,充分透析或以SephadexG25除戊二醛,小量分装后保存于低温冰箱,避免反复冻融。或冷冻干燥保存。
⑵ 二步法:是先使酶与戊二醛反应,除去未反应的戊二醛,再使已“活化”的酶分子与抗体分子的氨基结合,最后加入少量的赖氨酸封闭被戊二醛激活的酶的残基。二步法操作:将10mg的酶溶于0.2ml含1.25%戊二醛的0.1mol/L pH6.8 PBS中室温放置18h,充分透析或以SephadexG25柱除去未反应的戊二醛。加生理盐水至1ml然后加入1ml(含5mg)的抗体溶液和1ml 1Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液,混合后4℃冰箱放置24h,加入0.1ml 0.2mol/L赖氨酸,置室温2h,以0.15Mol/L pH7.2 PBS液充分透析,离心去沉淀,上清液即为酶结合物,再进一步以硫酸铵沉淀纯化后应用。AKP一般不采用二步法,而只用一步法。
改良HRP二步标记法:取HRP10mg溶于0.4ml,0.25Mol/L pH6.8PBS液中或0.05Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液中,加入25%戊二醛0.1ml,37℃温育2h后加入冰冷的分析纯的无水乙醇2ml,2 500r/min离心沉淀10min~15min,倾去溶液。沉淀以80%乙醇4ml~5ml混悬,同上离心,倾去乙醇,将管倒置,使乙醇充分流出。沉淀用1ml 0.05Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液溶解,加入0.5ml~1ml 抗IgG抗体溶液(含抗体15mg左右),放在冰箱内过夜后,加KH2 PO4,使近中性即可应用。
2.氧化法  采用过碘酸钠,过碘酸钠是强氧化剂,能将HRP的甘露糖部分(与酶活性无关的部分)的羟基氧化成醛基,然后与抗体的氨基结合,形成酶标抗体。
(1)氧化法操作过程如下:将5mgHRP溶于新配制的1ml 0.30Mol/LpH8.1重碳酸钠中,加0.1 ml 1%氟二硝基苯(FDNB)无水乙醇溶液,在室温中混合后,再加入1ml 0.04Mol/L~0.08Mol/L过碘酸钠(NaIO4),置室温中轻搅30min,在溶液呈黄绿色时,加1ml 0.16Mol/L乙二醇溶液,在室温中放置1h,使氧化反应中止,然后在4℃中对0.10Mol/L pH 9.5重碳酸钠缓冲液透析,换液3次。在3ml HRP-醛基溶液中,加入5mg(溶于1ml的碳酸盐缓冲液中),室温置2h~3h,加入5mg氢化硼钠(NaBH4),于4℃冰箱放置3h或过夜,然后用PBS液充分透析,离心去沉淀物。上清液即为酶结合物,纯化后使用。
(2)改良过碘酸钠法:①取5mg HRP溶于0.5ml双馏水中,加入新配制的0.06Mol/L NaIO4水溶液(10ml双馏水+128mg NaIO4) 0.5ml,混匀,置4℃30min;② 取出后加入0.16Mol/L乙二醇水溶液(10mlH2O+0.09ml乙二醇)0.5ml,室温放置30min;③加入含5mg纯化抗体的水溶液1ml,混匀,并装入透析袋,对0.05Mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液缓缓搅拌透析6h(或过夜),使之结合;④加入NaBH4溶液(5mg/ml)0.2ml,混匀,置4℃2h;⑤在以上溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液,混匀,4℃30min,离心,去上清,沉淀以少许0.02Mol/L pH7.4 PBS液溶解,装入透析袋,以同样液体在4℃透析除盐过夜;⑥次日取出离心,以除去不溶物,即得酶-抗体(HRP-IgG)结合物,以0.02Mol/L pH 7.4 PBS液加至5ml;⑦效价测定合格后,加入等量优质甘油,分装小瓶,低温保存。
表  戊二醛法与过碘酸钠法比较
比较项目
 戊二醛法 过碘酸钠法

 一步法 二步法 
标记方法 简单 较复杂 较复杂
酶利用率 2~4% 2~4% 70%酶偶联到99%抗体上
产率 <5% <5% >50%
标记抗体分子量 750万 <25万 >40万
穿入组织能力 差 好 一般
抗体活性丢失 多 少 较多
酶活性丢失 多 少 较多
染色效应 差 较好 较好
3.二马来酰亚胺法  二马来酰亚胺(Dimaleimide)能与蛋白质半胱氨酸的硫基反应。首先用α-巯基乙胺还原蛋白质(IgG),并用N、N‘-O-苯二马来酰亚胺活化,然后除去多余的试剂,最后使含二马来酰IgG与含硫基的β-半乳糖苷酶连接。具体操作如下:将抗lgG抗体溶于0.1Mol/L pH5.0醋酸钠缓冲液并对同一缓冲液透析平衡过夜,离心除去不溶性物质,抗IgG(14mg/2ml)与10mlα-巯基乙胺在37℃温育90min。过Sephadex后浓缩使每ml含3.0mg左右的还原抗IgG。在0℃中,按1︰1滴加饱和N、、N‘-O-苯二马来酰亚胺溶液,混合,于30℃温育20min,过SephadexG25柱,除去未反应的二马来酰亚胺。收集二马来酰亚胺“活化”的抗IgG,浓缩使浓度为OD280nm=1.0(光径1cm),取1ml溶液加20μl(5mg/ml)β-半乳糖苷酶,置30℃20min,用0.10Mol/L NaOH中和后,于4℃置24h~72h,再过Sepharose-6B柱(1.5×40cm),以pH7.0PBS洗脱,收集酶结合物,加叠氮钠(NaN3)防腐,4℃保存备用。
(二) 酶标抗体结合物的纯化 
在酶标记的溶液中,出现的是各种交联物的混合物,有酶-抗体、酶-抗体-酶、抗体-抗体、酶-酶,甚至还有游离的酶和抗体。在这中间,除了抗体-酶和酶-抗体-酶外,其它都应该给予除去。
1.50%饱和硫酸铵沉淀法。 此法只能除去游离的酶及酶-酶聚合体。而不能除去其它不需要者。但是此法对酶标抗体的损耗少。
2.过SephadexG200或Sepharose-6B柱。此法较繁琐,而且对酶标抗体的损耗较大,但提纯的质量好。
(三)酶标抗体的鉴定
1.酶标抗体的活性鉴定  一般以琼脂扩散和免疫电泳进行鉴定。使酶标抗体和相应的抗原(抗原浓度为1mg/ml)产生沉淀线,洗涤后于底物溶液中显色,显色后用生理盐水漂洗,沉淀线不褪色,说明酶和抗体都具有活性。良好的酶标结合物琼脂扩散滴度一般应在1:16以上。
2.酶结合物的定量测定  包括酶量、IgG含量、酶与IgG克分子比值以及结合率的测定。
酶量(µg/ml)=OD403nm×0.42     
(1)戊二醛法:IgG(mg/ml)=(OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62
(OD403×0.42为酶在403nm的光密度,抗体与酶-戊二醛结合后OD280nm约增加6%,所以乘以0.94校正。由于兔IgGOD280nm=1.0时为0.62mg,所以又乘以0.62)。
(2)过碘酸钠法:IgG(mg/ml)=(OD280-OD403×0.30)×0.62
 
(40 000和160 000分别为辣根过氧化物酶和IgG的分子量)。
⑷ 酶结合率=结合物中的酶量/标记时加入的酶量×100%。
⑸ 酶标记率:OD403nm/OD280nm即酶中正铁血红素辅基的吸光度(403nm)与抗体-酶蛋白中的色氨酸、酪氨酸的吸光度(280nm)之比表示HRP在AbE中所占的比例,它与E/Ab克分子比值呈高度正相关。
3.酶结合物的质量标准  纯化的酶结合物的质量标准应包括以下几个方面。
(1)酶的催化活性。
(2)免疫学活性。
(3)未联接的游离酶的量。
(4)未联接的原始免疫反应物的量。
(5)每个酶分子所联接的免疫反应物分子数目。
(6)生化性质。
(7)酶标记免疫试验效果。
酶结合物的质量差异,可引起试验敏感度的很大变化。例如用不同的程序制得的HRP-IgG结合物进行酶标记免疫试验,可得到不同的试验结果,故应予重视。
  表 用于ELISA酶标抗体的各项指标参数
评价 最好 好 一般
酶结合量(mg/ml) ≥1.0 ≥0.5 0.4
酶结合率(%) >30 9~10 7
酶IgG克分子比 >1.5 1.0 0.7
(五)酶标抗体的保存
分装小瓶,冻干低温保存。也可分装小瓶,在4℃或0℃以下保存。加甘油或牛血清白蛋白(最后浓度为33%)保存更好。避免反复冻融。保存期:一般1~2年活性不变。

E 抗酶抗体及酶-抗酶复合物的制备
抗酶抗体的优点,在于酶和抗体结合时,不需要通过化学交联剂交联,抗体的失活少。在酶复合物形成后,同时就具有酶的活性,遇到相应的底物即呈现催化显色作用。必须注意,抗酶抗体必须用与第一抗体同种来源的动物制备。
(一)抗酶抗体的制备
于家兔的两个后足掌内各注入弗氏完全佐剂(含活卡介苗12mg/ml)和过氧化物(5mg/ml)
的等量混合乳化液0.5ml,两星期后,于两侧腘淋巴结内注入同样液体。一周后静脉注射0.2ml~0.4ml,过氧化物酶液(同样浓度), 并同样强化2-3次,末次注射后一周验血、分离血清即为过氧化物酶抗体。
(二)酶-抗酶复合物(PAP)的制备
1.取单价特异性抗酶血清10ml,1.5×104r/min(4℃)离心20min,吸取上清。
2.于上清液中滴加酶溶液(0.5mg/ml)直至不再产生沉淀,静置1h,1.5×104r/min离心20min。
3.将沉淀物用冷生理盐水125ml洗三次,每次1.5×104r/min离心20min。
4.于冰浴下,将沉淀物悬混于4ml HRP(2mg/ml)中。
5.在pH计监测下,边搅拌边加0.1Mol/L或0.01Mol/L HCl至pH 2.3。此时沉淀已全部溶解,1.5×104r/min离心20min。
6.吸取上清,用0.1Mol/L NaOH调pH至7.4。
7.量体积,加入1/10容量的0.075Mol/L醋酸钠和0.15Mol/L醋酸铵的等量混合液。
8.逐滴加入等体积的100%饱和硫酸铵,搅拌20min。1.5×104r/min离心20min。
9.将沉淀物用50%饱和硫酸铵洗1次,同样离心。
10.将沉淀物悬混于5ml蒸馏水中,以pH6.75缓冲盐水透析3天,每天换水1次。(缓冲盐水由1.35×104ml生理盐水, 25ml 1.5Mol/L醋酸钠和75ml 2Mol/L醋酸铵配成)。
11.1.5×104r/min(4℃)离心20min,吸取上清,于OD280nm和OD403nm测定,计算IgG和酶含量及克分子比值。
12.按0.1ml分装,-20℃保存。
13.应用时从低温冰箱中取出,立即在37℃水浴中融化。

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抗原
  抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质。抗原进入机体后,可刺激机体产生抗体和引起细胞免疫。在免疫测定中,抗原是指能与抗体结合的物质。能在机体中引起抗体产生的抗原多为分子量大于5000的蛋白质。小分子化合物在与大分子蛋白质结合后能引起机体产生特异性抗体的,称为半抗原(hapten)。例如某些激素、药物等。抗原的反应性取决于抗原决定簇(antigenic determinant),或称为表位(epitope)。一个抗原分子可带有不同的决定簇。
抗体
1 抗体的结构
  抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五类,即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。与免疫测定有关的Ig主要为IgG和IgM。Ig由两个轻链(L)和两个重链(H)的单体组成。Ig的轻链是相同的,有κ(kappa)和λ(Lambda)两种型别。五类Ig的重链结构不同,这决定了它们的抗原性也不同。IgG和IgM的重链分别称为γ(gamma)链和μ(mu)链。IgG的结构见图。
  IgG可被木瓜蛋白酶分解为三个区段,其中两个相同的区段称抗原结合片段(Fab)。每个Fab都保存结合抗原的能力,但只有一个抗原结合位点,是单价的,与抗原结合后不出现凝集或沉淀。另一区段称Fc段,无抗体活性,但具有IgG特有
的抗原性。
  IgG可被胃蛋白酶分解为两个片段,一个Fab双体,称F(ab')2,能和两个相同的抗原结合;另一片段类似Fc,随后被分解成小分子多肽,无生物活性。
  IgM是由五个单体组成的五聚体,含10个重链和10个轻链,具有10个抗原结合价,由于空间位置的影响,只表现为五个抗原结合价。IgM分子量约为900000,IgG分子量约为150000。
  机体被微生物感染后,先产生IgM抗体,然后产生IgG抗体。经过一段时间,IgM抗体量逐渐减少而消失,而IgG抗体可长期存在,在疾病痊愈后可持续数年之久。
IgM抗体一般为保护性抗体,具有免疫性。因此IgM抗体的测定,对某些传染病如甲型肝炎有较高的临床诊断价值。

2  抗体的产生
  机体受抗原刺激后,B淋巴细胞产生相应的抗体。含有抗体的血清称为抗血清(antiserum)。每一系B细胞只产生针对某一抗原决定簇的抗体。如将多种抗原或含有多个抗原决定簇的抗原注入机体,则将由多系的B细胞产生相应的多种抗体,这些抗体均存在于免疫血清中。免疫测定中所用的抗血清一般用抗原免疫兔、羊或马制得。产生抗体的B细胞可在体外与繁殖力强的肿瘤细胞融合成杂交瘤细胞。将单个杂交瘤细胞分离,在体内或体外培养而分泌的抗体单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb或Mab)。单克隆抗体仅针对一种抗原决定簇,具有很高的特异性。单克隆抗体通常用抗原免疫小鼠制备。将免疫的脾细胞(含产生抗体的B细胞)与小鼠肿瘤细胞融合,分离杂交瘤细胞,接种于小鼠腹腔,产生的腹水中含有浓度很高的单克隆抗体。
抗原抗体反应
1 可逆性  抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡,其反应式为:Ag+Ab→Ag•Ab。.抗体的亲和力(affinity)是抗原抗体间的固有结合力,可以平衡常数K表示:K=[Ag•Ab]/[Ag][Ab]。Ag•Ab的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合,两者结合牢固,不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性,因此可用亲和层析法来提纯抗原或抗体。在抗血清中,特异性的IgG抗体仅占总IgG中的极小部分。用亲和层析法提取的特异性抗体,称为亲和层析纯抗体,应用于免疫测定中可得到更好的效果。
2 最适比例  在恒定量的抗体中加入递增量的抗原形成抗体复合物(沉淀)的量见图1-4。曲线的高峰部分是抗原抗体比例最合适的范围,称为等价带(zone of equivalence)。在等价带前后分别为抗体过剩带和抗原过剩带。如果抗原或抗体极度过剩,则无沉淀物形成,在免疫测定中称为带现象(zone phenomenon)。抗体过量称为前带(prezone),抗原地过量称为后带(postzone)。在用免疫学方法测定抗原时,应使反应系统中有足够的抗体量,否则测得的量会小于实际含量,甚至出现假阴性。

3 特异性  抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系,所以抗原抗体反应具有高度的特异性。例如乙肝病毒中的表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)和核心抗体(HBcAg),虽来源于同一病毒,但仅与其相应的抗体结合,而不与另外两种抗体反应。抗原抗体反应的这种特异性使免疫测定能在一非常复杂的蛋白质化合物(例如血清)中测定某一特定的物质,而不需先分离待检物。
  但是这种特异性也不是绝对的。假使两种化合物有着部分相同的结构,在抗原抗体反应中可出现交叉反应。例如:绒毛膜促性腺激素(hCG)和黄体生成激素(LH)均由α和β两个亚单位组成,其结构的不同处在β亚单位,而两者的α亚单位是同类的。用hCG免疫动物所得的抗血清中含有抗α-hCG和抗β-hCG两种抗体,抗α-hCG抗体将与LH发生交叉反应。在临床检验中,如用抗hCG抗血清作为妊娠诊断试剂检定尿液中hCG,只能用于hCG浓度较高的试验,否则妇女生理性排泄入尿液中的微量LH将与之发生交叉反应。因此在作为早孕诊断(敏感度应达到50mIu/mlhCG)的实际中必须应用只对hCG特异的抗β-hCG,以避免与其它激素的交叉反应的发生。
1.3.4 敏感性  在测定血清中某一物质的含量时,化学比色法的敏感度为mg/ml水平,酶反应测定法的敏感度约为5~10μg/ml,免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿。标记的免疫测定的敏感度可提高数千倍,达ng/ml水平。例如,用放射免疫测定法或酶免疫测定法测定HBsAg,其敏感度可达0.1ng/ml。
免疫测定在临床检验中的应用
  由于各种抗原成份,包括小分子的半抗原,均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体,利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原,因此免疫测定的应用范围极广,在临床检验中可用于测定:
    1) 体液中的各种蛋白质,包括含量极少的蛋白质如甲胎蛋白等。
    2) 激素,包括小分子量的甾体激素等。
    3) 抗生素和药物。
    4) 病原体抗原,HBsAg、HBeAg等。
    5) 另外,也可利用纯化的抗原检测标本中的抗体,例如抗-HBs等。
标记的免疫测定
  如上所述,免疫测定是一种很敏感的测定方法,抗原抗体反应后直接测定形成的沉淀或浊度,敏感度可达5~10μg/ml,但在临床检验中,某些待测物在标本中的含量远低于这一水平,因此要寻找增加敏感度的方法。标记的免疫测定是将检测试剂中的抗原或抗体用可微量测定的物质加以标记,通过测定标记物来提高敏感度。在放射免疫测定和酶免疫测定中,标记物分别为放射性核素和酶,最后用测定放射性和酶活力来计算待检物的量,敏感度可比直接测定沉淀物提高数百至数千倍。在标记免疫测定中,一般加入过量的标记试剂以保证与待测物彻底反应。以标记抗体(Ab※)检测抗原(Ag)为例,反应式如下:Ag+ Ab※ → AgAb※+ Ab※。在反应产物中有与Ag结合的Ab※和游离和Ab※,如不将两者分离而测定标记物,测得的结果将为两者之和。因此,游离标记物与结合标记物的分离是标记免疫测定中的重要步骤。可采用多种手段,固相载体是其中之一。如将抗原或抗体包被在固相载体上,然后再与标记的抗原或抗体直接反应,结合的标记物被固定在载体上,而游离的标记物留于溶液中。这样可以通过洗涤将游离的Ab※除去,结合标记物的测定可在固相上进行。

免疫检测的质量控制回目录

A 质量控制(Quality Control,QC)

实验室质量控制编辑本段回目录从1949年美国College of American Pathologists(简称CAP)首先开始研究临床实验室室内质量控制(简称质控)问题,美国学者Levery和Jenning于1950年发表第一篇关于使用质控图的实验室室内质控,临床检验实验室的室内质控工作正式拉序幕。
  到70年代,实验室质量控制进入一个新的阶段--全面质量管理,推行Good Laboratory Parctice(简称GLP)。进入80年代末期,GLP的统一标准产生了,发展到"认证实验室"管理阶段。
  全面质量管理的宗旨在于预防差错的产生。质控图的统计学质控的目的是检出差错。统计学的实验室室内质控是全面质量管理中的一个重要环节。
  卫生部临床检验中心免疫质控室从1988年开始在全国范围内开展乙肝标志物检验的质量评价活动,一直采用这一套质量评价方法,并在实践中不断实践、提高和完善,希望能找出一条适合中国国情的,行之有效的质量管理的道路。
英国 Whitehead 教授建议生化检验工作的质量控制分为4 个步骤:最佳条件的变异(OCV);常规条件的变异(RCV);病人结果的统计(SPR);室间质量控制(EQA)。前三个步骤即室内质量控制(IQC)。
在GLP 概念里QC 即指IQC,其定义为:由实验室工作人员采取一定的方法和步骤,连续评价本室工作的可靠性,旨在监测和控制本室常规工作的精密度,提高批内批间样本检验的一致性,以确定检验报告是否可靠或可否发出的一项工作。
免疫测定方法的灵敏度和特异性要比生化方法高得多,因此QC 手段不能照搬生化模式。分为定性和定量二个方面。

免疫测定方法的定性试验质量控制

ELISA 定性试验的临床意义在于是否检出病原体,与检出量无关,因此QC 要保证试验的灵敏度和特异性。生化的质控图方法仅能观察灵敏度而无法监控特异性。
建议使用临界值血清界定法:将试剂盒所设的阴阳性对照作为内对照指示反应;另设临界值、高值质控血清,正常人血清作为外对照,与标本同时检测,临界值S/C.O≥1,高值质控血清 S/C.O≥10,正常人血清A 值在0.05~0.07 之间。
◎阳性质控血清失控(临界值为灵敏度,高值为"HOOK" 效应监控)应重做阴性标本;阴性对照失控应重做阳性标本。
◎以表格式记录每块板的外对照实验结果,作为QC 资料存档。

免疫测定方法的定量试验质量控制编辑本段回目录ELISA 定量试验常见于肿瘤因子(如AFP,CEA,CA 系列),激素类,免疫球蛋白类,这些物质在体内有一定的量(正常范围),超出这个量才呈病理情况,故需定量测定。定量试验的质控方法可参考生化方式。
"即刻性"质控:在开始进行质控时,只需要有3 个质控血清测定值即可进行质控。当这组数据扩大到20 次有效值时就可以计算RCV 的X,s。方法:
(1)先将测定值从小到大排列,X1 最小,Xn 最大;
◎(2)计算X 和s;
◎(3)计算SI 上限值和下限值。
◎SI 上=(X 最小-X)/S, SI 下=(X 最大-X)/S
◎对照SI 表,检查是否出控,
SI 上、下限≤规定值,在控;
SI 上或下限>规定值,失控。
B ELISA质量控制

ELISA 是一种敏感性高、特异性强、重复性好的实验诊断方法,由于其试剂稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观等因素,以及既适宜于大规模筛查试验又可以用于少量标本的检测,既可以做定性试验也可以做定量分析等优点,已广泛应用于微生物学、寄生虫学、肿瘤学和细胞因子等领域。ELISA 的影响因素较多,加强质量管理才能充分发挥其方法学的优点。

质量控制血清

  质控血清是已有靶值的血清,在每次的常规检验中加入一份或数份,通过所得结果来了解本次检验的情况。质控血清检验的结果如能控制其误差在一定范围内,就说明该检验没有发生不允许的误差。如果出现超过允许误差范围的异常结果,提示该检验不合格,应寻找原因,纠正后,重检待测标本。因此质控血清在质控工作中起重要作用。
1 质控血清的使用
  卫生部临床检验中心制备的乙肝标志物质控血清,可以在-20℃保持半年定值不变。冰冻状态融化使用时,应先混匀,未用完部分可在4℃保存5天。不宜反复冰融或自行分装。开展某项检验的室内质控工作需要的质控血清,一般按3-6个月用量准备。自制的不定值质控血清,在一批质控血清将用完之前,需准备下一批质控血清。质控血清要求性能稳定,较长期内效价不变,其理化性质应与病人样本相近,这样才能有效地起到监测作用。
2 临界值质控血清
  质控制血清分定值和未定值两种。如只用一份质控血清定值,一般定在正常值与异常值交界点上,定性测定时处于弱阳性水平,称为临界值。乙肝标志物临界值的制定,应按临床要求,为临床提供统一的判断弱阳性的标准。 临界值质控血清可以作为试剂盒中的阳性对照品和阴性对照品以外的第三个对照品,它可以灵敏地反映出试剂盒的检出水平,确保弱阳性反应的标本不漏检。
3 质控血清的制备
    每个实验室可以根据自己的条件,选用临床中心提供的质控血清,或按以下方法自己制备本室使用的质控血清(以乙肝质控血清为例)。
1) 收集新鲜的无溶血、无黄疸、无细菌污染的阳性血清。
2) 56℃加热10小时来活。
3) 离心或过滤除去沉淀。
4) 用10%的小牛血清或正常人血清(PBS缓冲液)将收集的血清稀释至所需的浓度。如能用正常的人血清稀释更好,因其成份更接近于检测标本。
5) 抽滤除菌。按一次使用的量分装小安瓿,封口,20℃保存备用。不可反复冻融。被检物要求检出的水平常被认为是质控血清应选择的水平。如果该试验还有其它要求,则应加所要求浓度的质控物。
6) 标定含量。20-30次测定结果删除>±2SD数据的均值作为靶值,并与已知定值血清对比测定。

室内质量控制程序
  临床检验的检测结果,每次或每天之间不可能没有误差。决定允许的误差范围,以临床上不造成误诊与漏诊为准,通过以下步骤来确定质控范围。
1) 最佳条件下的测定误差。
2) 已知值的血清在常规检验条件下的误差。
3) 未知值的血清在常规检验条件下的误差。
4) 临床应用的要求。对任何一个试验都应确定一个允许的误差范围,前题是满足临床要求。如允许误差定得过小,在临床上不存在任何意义,但为了符合该规定却要花费很大人力、物力和时间。相反,如果将允许误差定得过大,将使监测系统察觉不到临床上要求检出的误差,失去质控的意义。

1 最佳条件下已知值质控血清变异(optimal conditions variance,简称OCV)的测定

在本实验室最佳条件下(包括操作者、试剂、仪器等)检测质控血清20-30次,测得结果计算,求出该组数据的均值和标准差(SD)表示该实验室的最佳工作质量。
  现举例说明HBsAg ELISA法检测时OCV的测定。使用的质控制血清为临界血清,HBsAg浓度为5ng/ml。在该实验室中选择素质最好、操作最熟练的技术员进行认真地专门测定,选用最佳的试剂盒,检测之前,将恒箱、加样器等认真校正、调校正、调试,使用新的加样吸头等,即在最佳、最理想的条件下进行检测。除质控血清外同时测定阴性对照品和阳性对照品。并作双份测定,得出2个吸光值(A值),求出X。连续作20次,求出20个X,即X1……X20。从这20个数据中,求出OCV的X和SD。

2常规条件下已知值质控血清变异(routine conditions variance-known value,简称RCVK)的测定

  做常规检验的技术人员,在常规检验的条件下,将质控血清放在常规检测样本中,进行20次检验,结果计算同OCV法。一般认为RCV的SD在OCV的SD两倍范围内可以接受。若太大应该查找原因,使其向OCV的SD值靠近。在改进实验室条件后(例如较正加样器,纠正洗板操作,调正温育温度等),重新进行RCVK的测定。如果RCVK的SD值更小,说明OCV不是最佳条件下测定的,应重新再测OCV。常规条件下,RCVK肯定要比OCV大。通过质控控制各项条件,使RCVK的数据尽可能接近OCV值。RCVK的数据反映该实验室日常工作的质量,用于作质控图,对室内检验的结果进行控制,每日检验的结果,报告能否发出。

3常规条件下,未知值质控血清变异(routine conditions variancl-unknown value 简称RCVU)的测定编辑本段回目录  有时为了避免主观性,再作RCVU测定。测定步骤同RCVK,但检测的操作者不知质控血清的定值,或在操作者不知哪份是质控血汪清的条件下进行常规检验,以排除操作者的主观性。在此不再举例说明。

4质控图

  通过以上三步骤,可以开始作室内质控图,根据RCVK的和SD作质控框图。利用质控图可以对每次检验的结果进行监测,当没有更换另一批号试剂盒和另一批号质控血清时,该质控图可以连续作下去。 质控血清的S/CO值低于-2SD的范围,属"告警",应寻找原因并在质控图上记录查出的原因。
  ELISA试验中,各种检验项目的误差允许范围均有待在实践中得出结论,以上只是举例说明质控方法,不是定论。2SD是一般公认的允许误差限度。每批测定放一份质控血清时,一次超过2SD应作为"告警",二次超出2SD为"失控"。当质控过程中,出现失控时,出现失控时,应查找原因,通常是试剂盒或质控血清失效造成。更换试剂盒或更换质控血清,找出原因纠正后重新检验。如果检验结果仍达不到要求或找不到原 因时,应重复进行OCV的检验。如果OCV检验的结果仍是好的,说明常规操作出现问题。
一般认为:①一次超出3SD;②连续二次超出2SD;③3-5次连续处于一侧的2SD之内;
     ④5~7次连续偏向横轴的一侧,均为失控。
第③、④种情况,单独依靠记录往往是不易察觉的,但在质控图上可以清晰地发现这种失控。
5统计学计算方法--"即刻性"质控
  以上介绍的质控方法基本上与临床化学测定的质控方法相同,但ELISA有其特殊性,最合适的质控方法尚待研究建立。有些实验室不是每天进行ELISA项目的检验,而ELSIA试剂盒效期短,用一批号试剂盒连续常规测20次,难度较大。采用"即刻法"质控统计方法,只需连续测3次,即可对第3次检验结果进行质控。"即刻法"的建立具体计算方法如下:
1)先将测定值从小到大排列
2)计算X和SD。
3)计算SDI上限和SDI下限值。
4)将SDI上限、SDI下限值与SDI值中的数字比较。当SDI上限值和SDI下限值<n2SD时,表示处于控制范围内,可以继续往下测定,继续重复以上各项计算;当SDI上限和SDI下限有 一值处于n2SD和n2SD值之间时,说明该值在2SD~3SD范围,处于"告警"状态;当SDI上限和SDI下限有一值>n2SD时,说明该值已在3SD范围之外,属"失控"。数值处
 于"告警"和"失控"状态应舍去,重新测定该项质控血清和病人样本。舍去的只是失控的这次数值,其他次测定值仍可继续使用。
  即刻性质控统计方法,适于ELISA测定的质控。
  当检测的数值超过20次以后,不必再使用"即刻法"质控统计计算,可以转入常规的质控图的质控。将前20次的数值求出的和SD作质控框架图,第21次的数值,依次点入即可。

室间质量评价(external quality assessment,简称EQA)

  室间质量评价简称室间质评,是由质控中心采用一系列的办法连续地、客观地评价各实验室的试验结果,并发现室内质控不易发现的不准确性,了解各实验室之间结果的差异,并帮助校正,使具有可比性。各实验室试验结果报到质控中心,经过统计分析,得出相互比较的结果。这种评价不能控制各实验室每天发出的检验报告,而是一种回顾性评价。室内质控主要监测试验结果的精密度,而室间质评主要控制试验结果的准确度,不能互相替代。参与质评的实验室应先做好室内质控。

室间质评的方法

1、 发质控物进行调查
  这是国内外室间质评的常用形式。部临检中心对乙肝标志物ELISA检验的室间质评采用定期发放质控物至各实验室,各实验室在规定的日期进行检验,并将检验结果报至部临检中心。部临检中心经统计分析,将评价结果寄回各实验室。通过评价,各实验室了解本室工作质量,发现差距,并设法改进,以不断提高检验质量。
  这种评价方式有一定缺点,即各实验室常对质控物特殊对待,在检验时选用特殊试剂盒,选派特别的技术员进行检验,有的实验室互相和对结果并作修改。这就使EQA的结果不能反映该实验室日常工作水平。
2、 派观察员到实验室进行试剂调查
  这种调查事先不通知,临时派观察员到实验室,指定采用常规方法,检验规定的一组标本,进行评价。
  这种调查方式,容易发现该实验室存在的实际问题,可以直接给予指导和帮助,解决问题,提高检验质量。这种调查通常可以使用真实样本,避免采用质控物的一些缺点。

评价方法

1)发质控物进行调查,这是目前国内外常见的形式,采用定期发放质控物至各实验室,各实验室在规定的日期进行检验,并将结果报至组织者(部、省临检中心)。组织者通过统计分析,再将评价结果寄回实验室,使其了解工作质量,发现问题,提高质量。其缺点为由于各实验室吃小灶或互相打电话修改结果而达不到真正评价作用。
2)现场调查,事先不通知,临时派出人员到各实验室,规定采用常规方法,检测一组标本,进行评价。这种方法可以解决实际问题,进行现场指导,组织者常因人力、物力的原因而不能经常性进行。

成绩计算方法
定性试验:检验结果与预期结果一致,得 100 分,错误不得分,总计实验室的得分。从全部参评单位的得分中求出该批质控物平均分(X)和标准差(s),再通过公式计算出每一个实验室的得分比值(SI)
SI=(实验室得分-平均分X)/平均标准差(s)
SI 在0.0-0.9 间为良好,1.0-1.9 间为优秀,SI 为负值时数值越大成绩越差。
定量试验:SI= (实验室测定值-预期值X)/预期值的标准差s ; SI 越小,表明越靠近靶值,成绩越好。
0-1.0 为优秀,1.1-2.0 为良好,>2.0 为差。SI 无正负之分

质量改进(Quality Improvement,QI)编辑本段回目录
质量改进的建议来源于三方面:
(1)室内质控:提示实验的精密度差,应规范各项操作;
(2)室间质评:提示实验的准确性差,应改进设备的准备或更换试剂;
(3)病人或医生的报怨:提示实验的偶然误差,应分析实验的质控过程是否达标。

记录
◎所有实验的原始资料均应存档;所有的记录均应规范登记在册;原始登记表应记录试剂来源、批号;质控血清的来源及测定值并注明是否在控;签上实验者姓名及审核者姓名。
◎如试验结果对临床诊断有决定意义,其样本应保留,至少与病历保存期一致。
C 分析前质控编辑本段回目录
分析前质控编辑本段回目录人员培训实验是人操作的,因此检验人员需经过培训,熟练掌握本专业如下几方面的技术知识:
◎检验项目的基本原理(ELISA 原理);
◎临床意义;
◎熟悉检测技巧,了解易出差错的环节及难点;
◎熟悉检测试剂性能(包括试剂盒组成,包被片段及其组成);
◎ 熟悉检测仪器的原理及性能;掌握数据处理的能力和质量控制知识。
◎某些特殊项目的检测如抗HIV 等需经有关部门组织的专门培训班,考试合格后持证上岗。
◎ELISA 原理:1971 年Engvall 等人把免疫组化的EIA 技术应用于临床检验发展为ELISA 技术。
特点:在固相表面组装免疫活性物质形成"免疫吸附剂"
酶标记免疫活性物质,进行信号放大;
有二步温育反应二次洗涤过程;
灵敏度特异性相对较高。
局限性:只能检测到ng 水平
精密度差(批内CV15-20%);
线性范围窄(一个数量级);
存在"HD-HOOK" 效应。

试剂盒选择

以乙肝检测为例,卫生部规定乙肝试剂,丙肝试剂,艾滋病试剂,梅毒试剂及血型试剂必须使用经卫生部生物制品检定所检定合格,并贴有防伪标签的产品,试剂应从灵敏度,特异性,精密度,稳定性,简便性,安全性及经济性作出全面的评价。
◎灵敏度:有二层含义,1)为试剂检出被检物质的最低量的能力;2)为试剂对人群或大量样品中阳性检出的能力(假阴性越少越好),取决于包被物的全面性。
◎特异性:指试剂正确检定不存在的被检物质的能力(无假阳性),取决于包被抗原(体)及标记抗原(体)的纯度及特异性。
◎精密度:ELISA 试剂一般指其批内CV,其值应小于15%;定量试剂应同时考察线性范围
◎稳定性:试剂在规定条件下能储存的时间,一般采用破坏性试验即将试剂存放于37℃保存,定期测定其灵敏度,特异性和精密度等指标,直到其质量指标开始下降为止,通常认为37℃每稳定一天相当于4-10 ℃保存一个半月。
◎简便性:指在不影响试剂的前三项指标的前题下,实验和测定步骤越少越好,在定性试验中结果判断简单明了,)定量试验结果计算也应简单。
◎安全性:指试剂对操作者和环境安全无害无传染性。
◎经济性:试剂在同等质量条件下通过大规模生产或技术进步降低成本而市场价格比较合理。

仪器质控

为使仪器保持最佳工作状态应建立维护和校正仪器的标准操作程序(SOP),所要控制的仪器包括移液器(加样枪),水浴箱(温箱),洗板机和酶标仪。
◎移液器:ELISA 加样量小(5-100ul),其准确性直接影响实验结果,利用称重法检查:吸取刻度指示量的水,万分之一天平称重后计算吸量是否准确,一般应在±10%以内;
◎水浴箱经常检查水浴箱温度计所示的温度和水中(或温箱内)实测温度是否一致,允许有±1℃的误差;
◎洗板机每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定一般不超过2ul ,人工扣板时,垫纸不湿,定期检查管孔是否堵塞;
◎酶标仪经常维护其光学部分,防止滤光片霉变,定期检测校正,使其保持良好的工作性能。

酶标仪校正程序
◎滤光片波长精度检查:将不同波长的滤光片从酶标仪上卸下,用UV-2201 型紫外-可见分光光度计(波长精度±0.3nm)于可见光区对每个滤光片进行扫描,其检测值与标定值之差为滤光片波长精度。
◎通噵差与孔间差检测:通道差检测是取一只酶标板小孔杯(杯底须光滑,透明,无污染以酶标板架作载体,将其(内含200ul 甲基橙溶液吸光度调至0.500A 左右)置于8 个通道的相应位置,蒸溜水调零,1 于490nm 处连续测三次 ,观察其不同通道的检测器测量结果的一致性,可用极差值来表示。孔间差的测量是选择同一厂家,同一批号酶标2 板条(8 条共96 孔)分别加入200ul 甲基橙溶液(吸光度调至0.100A 左右)先后置于同一通道,蒸溜水调零,于490nm 处检测,其误差大小用±1.96s 衡量。
n 零点飘移(稳定性观察):取8 只小孔杯分别置于8 个通道的相应位置,均加入200ul 蒸溜水并调零,于490nm 处每隔30 分钟测一次,观察各个通道4 小时内吸光度的变化。
◎精密度评价:每个通道3 只小杯分别加入200ul 高中低3 种不同.浓度的甲基橙溶解,蒸溜水调零,于490nm 作双份平行测定,每日测二次(上下午各一次),连续测定20 天。分别计算其批内精密度,日内批精密度,日间精密度和总精密度及相应的CV 值。
◎线性测定:用电子天平精确称取甲基橙配制5 个系列的溶液,于490nm 平行测8 次,取其均值。计算其回归方程,相关系数及标准估计误差s,并用±1.96s 表示样品测量的误差范围.双波长测定评价:取一分甲基橙溶液,分别加入3 种不同浓度的溶血液(测定波长为490nm,校正波长为585nm),先后于8 个通道检测,每个通道测3 次,51 比较各组之间是否具有统计学差异,以考察双波长消除干扰组分的效果。
◎一般酶标仪无585nm 滤光片,可选用550nm 或630nm 滤光片。450nm 滤光片的检定选用普鲁兰溶液(校正波长为630nm)

试剂盒评价
◎试剂评价需要有权威的血清考核盘( Panel)进行检测,一般实验室不易从生检所或临检中心取得,每进一次试剂评价一次也很麻烦。可以通过间接的信息对试剂进行选择。
◎根据该试剂生检所批批检定报告,了解其质量水平,按照质量计划选择灵敏度高的或特异性高的试剂;
◎通过询问试剂包被物的组成,如原料来源(基因工程或合成多肽),片段的组合(按比例混合或化学合成), 片段的长短等判断试剂的优劣;
◎参考室间质评评价报告中对试剂的评价结果,这比较客观公正,因为统计数字均来自各参评医院,反映了试剂在某一地区的使用情况;
◎根据权威部门发布的试剂评价结果,了解市场上试剂的质量优劣。

标本的采集和保存

◎可用作 ELISA 的标本十分广泛,体液(如血清,血浆,各种积液),分泌物(如唾液)和排泻物(如粪便,尿液)均可作为标本以测定其中的抗原或抗体成分,一般使用血清。
n 标本采集时应尽量避免溶血,因红细胞破裂可释放过氧化物酶活性物质干扰立可读方法的结果,可造成假阳性;长菌的标本同样的道理易产生假阳性。
◎抗凝不完全的标本因纤维蛋白元的干扰而造成假阳性,建议尽量不用抗凝血尤其是用肝素抗凝剂。
◎标本在冰箱中保存时间过长易导致血清IgG 聚合,使间接法的试剂本底加深,一般血清置4℃冰箱5 天内完成测试。如需保存一周以上则要-20℃冰冻保存,融解时应上下颠倒充分混匀,同时避免气泡。
◎ELISA 的灵敏度>1ng/ml 水平上,标本间的污染要尽量避免,尤其不应与生化试验用同一管标本.最起码应先做免疫后做生化。

D 分析中质控
ELISA 实验的结果受操作影响很大,每个步骤包括加样,温育,洗涤,显色,酶标仪读数均应认真负责才能充分发挥ELISA 的高灵敏,强特异的优点。因此,应建立实验项目的标准操作程序(SOP)。
 加样
◎加样应用微量移液器(加样枪)按规定的量加入微孔板的1/3 处避免加在孔壁上部,并注意不可溅出,不可产生气泡。
◎每次加样应更换吸嘴,做到一人一吸头,以免发生交叉污染;干吸头预先在血清中抽吸三次。
◎样本稀释,目的是为了减少非特异性反应,所以一定要先加稀释液后加样本,特别注意加样后要在微量振荡器上振荡30 秒钟,同时注意防止液体溢出。如后面操作步骤中加二种以上试剂时均需振荡混匀。
◎如用滴瓶滴加试剂应先将滴瓶摇匀并挤去第一滴有气泡的试剂后加样。
 温育
◎抗原抗体反应需要在一定温度下(37°C),经过一定的时间才能达到反应的平衡点
◎ELISA 边缘效应是由温育形成的。所以温育一般采用能使反应液温度迅速达到平衡的水浴法。一种放在水浴箱的隔板上,另一种是放在温箱的湿盒里。水要浸至板条的1/3 处,不可将板条叠加放置。
◎边缘效应(2ng/mlHBsAg 一步法三种不同温育法的结果)
 洗涤
◎ELISA 是靠洗涤来达到分离结合与未结合抗原抗体复合物及酶标记物的目的,同时洗涤也可将非特异吸附的蛋白质的干扰以及血球、细菌中的酶干扰清除掉。
◎手工洗涤一般采用浸泡方法:1)甩去孔内反应液;
2)用洗涤液过洗一遍(即注满孔后即甩去);
3)微孔重新注满洗液后浸泡2-3 分钟,间歇摇动;
4)甩去孔内液体,拍板,用纸吸干。
重复以上操作至少5 次。注意各种试剂盒的洗涤液尽量不要混用。
◎洗板机洗板一定要预先把板架放平,使洗板机上的每个放液和吸液纤孔都能一致地插入孔底,将孔内液体全部吸干,同时要设置一定的浸泡时间。如出现机洗后拍板有较多残留液时应再用手工洗2 次以上。关机前要用蒸溜水冲洗管道,避免堵孔。
 显色
◎HRP 催化底物的一步呈色反应,同样需要一定的时间和温度,
◎ 一定要按照说明书规定的时间温度(一般为37°C,10-15 分钟)恒定反应后终止
◎或根据临界值质控血清吸光度值达0.2 左右使的时间而恒定反应时间.

酶标仪判读结果
◎显色反应终止后应立刻比色(30 分钟内)。
常见的显色系统有OPD 和TMB 二种,以后者最为常见,而TMB 酸不易终止因此必须尽快比色以免影响结果。OPD 终止后显棕色,测定波长为490nm; TMB 终止后显黄色,测定波长为450nm, 二种底物的校正波长均用6 30nm。使用双波长的优点可以消除反应板条上的划痕手印的干扰。同时要注意反应板应用纸吸干后才能置酶标仪中比色,否则吸光度易出现负值或损坏滤光片。

报告方式

◎定性试验国内外为便于统一计算,一律按S/C.O 方式报告,S 为标本A 值,C.O 即Cut Off 值(阳性判定值)
◎夹心法和间接法以S/C.O≥1 为阳性;
竟争法与中和法以S/C.O﹤1 为阳性
◎Cut Off 的计算公式以试剂盒说明书的为准常见的有:
◎A) C.O=2.1×N(当N 不足0.05 时按0.05 计),
◎此公式由P/N>2.1 换算而来,常用于夹心法。
◎B) C.O=0.5×N,从抑止率公式换算而来,
◎常用于竟争,中和法
◎C) C.O=N+C(C 为常数),用于间接法。
◎D) C.O=C×P+N(C 为常数),用于间接法。此公式最客观,但对生产厂家要求很高,阴阳性对照测定值要基本恒定。

报告方式
定量分析用已知量的标准品作一系列稀释,ELISA 测定,绘制标准曲线,结果以绝对量或单位表示。
ELISA 的标准曲线每次都要和待测标本做在同一块板上。
现有的ELISA 定量试剂盒标准曲线只有在较窄的浓度范围内成直线,要得到精确的结果实属不易。因此严禁用定性试剂盒做定量分析。

灰区概念
把定量分析的正常值范围引入定性分析建立灰区概念,即将CO 值上下的一段区域定为阳性可疑,需重复实验或换试剂重测以确定其阴阳性,如仍落在灰区范围内则报告+(阳性)。
灰区概念对血站系统的献血员筛查尤为重要。
灰区的设置有二种:
1)C.O×(1±CV),
CV 为该试剂的批内CV& nbsp; (一般在15-20%间);
2)C.O±2s,s 为实验室做室内质控ROC 的s 。

高值钩镰效应(HD-HOOK)
◎在二位点夹心ELISA 中,其剂量反应曲线的高剂量(HIGH DOSE,HD)区段,线性走向不是呈平台状无限后延,而是向下弯曲状,似一只钩子或一把镰刀(HOOK),MILES(197 4)根据此现象写实性地称之为"HD-HOOK" 效应。产生该现象的分子机理有"分子变构说"和"浓度效应"等推论。
◎一步法和二步法均存在,只是前者出现的更早些,大多数是高值低吸光度,很少阴性结果。
E ELISA试剂的临床质量评价

 ELISA试剂的评价(evaluation)分两个方面:一是试剂本身的质量评价,符合一定要求后才能生产供应;一是在临床应用中效果的评价。以肝炎ELISA诊断试剂为例,首先必须通过中国药品生物制品检定,以得到生产的许可。检定内容除包装、标签、说明书等外,对试剂的性能,如特异性、灵敏度、精密度和线性等均需逐项检定,通过对一系列参比品的检测,结果符合要求者才为合格。ELISA试剂的临床质量评价是用该试剂对临床样本进行检测,以观察其实际应用价值。部临检中心对乙肝ELISA诊断试剂在这方面进行了工作,通过质量评价,促进了试剂质量的提高。

诊断试剂临床质量评价要点

  从临床应用角度考核检验试剂的可靠性,是以其能否区分健康与疾病的能力作为依据的。目前还很难找到100%可靠的试验,任何试验都会出现假阳性或假阴性。判断试验的可靠性常以其灵敏度及特异性作为考核标准。临床应用的灵敏度用疾病患者试验阳性的百分率表示,特异性以无病者试验阴性的百分率表示。进行这种评价,首先需要收集有关的病人血清,然后用公认的检测该项标志物最可靠的试剂进行测定,以确定其为阳性或阴性。
  这一组表明测定物为阳性或阴性的血清组成"血清盘"(panel)。被评价的试剂测定此血清所得结果与血清盘标明的结果的关系如下表:
 血清盘结果 合计
 + -
受检试剂结果 + a b a+b
 - c d c+d
合计 a+c b+d A+b+c+d
表中a为真阳性,b为假阳性,c为假阴性,d为真阴性。
被评价试剂的各项性能指标按以下分式计算:
灵敏度(%)=a/(a+c)×100%
特异性(%)=b/(b+d)×100%
符合率(%)=(a+d)/(a+b+c+d) ×100%
一般认为灵敏度或特异性>90%为良好。符合率是综合灵敏度和特异性的指标。

临床考核血清盘的制备要求
1、 采用人的原血清;
2、 血清盘应具有相应的稳定性;
3、 血清盘中样本不含防腐剂,或只含极微量的、不影响检验结果的防腐剂;
4、 血清盘所包含的阴性样本和阳性样本约各占一半;
5、 阳性样本中,应有一定数量的强阳性和弱阳性样本;
6、 血清盘中应有一定数量的临界值上、下含量的样品,以检验试剂的灵敏度。
7、 血清盘中应包含与该项检验相关的病种样本和已积知具有干扰物质(RF因子)的样本,以检验试剂的特异性。

临床考核血清盘的建议

  以抗-HBc-IgM为例,部临检中心收集近百例临床肝炎病人的样本,经美国abbott公司抗-HBc-IgM试剂反复检验筛选。选出血清70份,其中阳性29份,阴性41份,组成抗-HBc-IgM临床考核血清盘。在70份样本中,除7份为无病历的质控血清外,抗-HBc-IgM阳性的22份样本中含临床诊断急性肝炎16例、慢性活动性肝炎5例、重症肝炎1例;抗-HBc-IgM阴性的40份样本中,含临床诊断慢性迁延性肝炎24例、急性肝炎例(均为恢复期采的血样)、慢性活动性肝炎8例(其中5例为恢复血样)。
  因此,这套抗血清盘用于商品试剂的临床考核,可以将临床上乙肝急性期、慢性活动期病人区分开,具有临床诊断意义。

 


 

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