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ELISA是一种免疫测定。免疫测定(immunoassay,IA)是应用免疫学技术测定标本的方法。在临床检验中主要通过抗原抗体反应检测体液中的抗体或抗原性物质。
1.1 抗原
  抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质。抗原进入机体后,可刺激机体产生抗体和引起细胞免疫。在免疫测定中,抗原是指能与抗体结合的物质。能在机体中引起抗体产生的抗原多为分子量大于5000的蛋白质。小分子化合物在与大分子蛋白质结合后能引起机体产生特异性抗体的,称为半抗原(hapten)。例如某些激素、药物等。抗原的反应性取决于抗原决定簇(antigenic determinant),或称为表位(epitope)。一个抗原分子可带有不同的决定簇。
1.2 抗体
1.2.1 抗体的结构
  抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五类,即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。与免疫测定有关的Ig主要为IgG和IgM。Ig由两个轻链(L)和两个重链(H)的单体组成。Ig的轻链是相同的,有κ(kappa)和λ(Lambda)两种型别。五类Ig的重链结构不同,这决定了它们的抗原性也不同。IgG和IgM的重链分别称为γ(gamma)链和μ(mu)链。IgG的结构见图。
  IgG可被木瓜蛋白酶分解为三个区段,其中两个相同的区段称抗原结合片段(Fab)。每个Fab都保存结合抗原的能力,但只有一个抗原结合位点,是单价的,与抗原结合后不出现凝集或沉淀。另一区段称Fc段,无抗体活性,但具有IgG特有
的抗原性。
  IgG可被胃蛋白酶分解为两个片段,一个Fab双体,称F(ab')2,能和两个相同的抗原结合;另一片段类似Fc,随后被分解成小分子多肽,无生物活性。
  IgM是由五个单体组成的五聚体,含10个重链和10个轻链,具有10个抗原结合价,由于空间位置的影响,只表现为五个抗原结合价。IgM分子量约为900000,IgG分子量约为150000。
  机体被微生物感染后,先产生IgM抗体,然后产生IgG抗体。经过一段时间,IgM抗体量逐渐减少而消失,而IgG抗体可长期存在,在疾病痊愈后可持续数年之久。
IgM抗体一般为保护性抗体,具有免疫性。因此IgM抗体的测定,对某些传染病如甲型肝炎有较高的临床诊断价值。

1.2.2  抗体的产生
  机体受抗原刺激后,B淋巴细胞产生相应的抗体。含有抗体的血清称为抗血清(antiserum)。每一系B细胞只产生针对某一抗原决定簇的抗体。如将多种抗原或含有多个抗原决定簇的抗原注入机体,则将由多系的B细胞产生相应的多种抗体,这些抗体均存在于免疫血清中。免疫测定中所用的抗血清一般用抗原免疫兔、羊或马制得。产生抗体的B细胞可在体外与繁殖力强的肿瘤细胞融合成杂交瘤细胞。将单个杂交瘤细胞分离,在体内或体外培养而分泌的抗体单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb或Mab)。单克隆抗体仅针对一种抗原决定簇,具有很高的特异性。单克隆抗体通常用抗原免疫小鼠制备。将免疫的脾细胞(含产生抗体的B细胞)与小鼠肿瘤细胞融合,分离杂交瘤细胞,接种于小鼠腹腔,产生的腹水中含有浓度很高的单克隆抗体。
1.3 抗原抗体反应
1.3.1 可逆性  抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡,其反应式为:Ag+Ab→Ag•Ab。.抗体的亲和力(affinity)是抗原抗体间的固有结合力,可以平衡常数K表示:K=[Ag•Ab]/[Ag][Ab]。Ag•Ab的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合,两者结合牢固,不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性,因此可用亲和层析法来提纯抗原或抗体。在抗血清中,特异性的IgG抗体仅占总IgG中的极小部分。用亲和层析法提取的特异性抗体,称为亲和层析纯抗体,应用于免疫测定中可得到更好的效果。
1.3.2 最适比例  在恒定量的抗体中加入递增量的抗原形成抗体复合物(沉淀)的量见图1-4。曲线的高峰部分是抗原抗体比例最合适的范围,称为等价带(zone of equivalence)。在等价带前后分别为抗体过剩带和抗原过剩带。如果抗原或抗体极度过剩,则无沉淀物形成,在免疫测定中称为带现象(zone phenomenon)。抗体过量称为前带(prezone),抗原地过量称为后带(postzone)。在用免疫学方法测定抗原时,应使反应系统中有足够的抗体量,否则测得的量会小于实际含量,甚至出现假阴性。

1.3.3 特异性  抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系,所以抗原抗体反应具有高度的特异性。例如乙肝病毒中的表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)和核心抗体(HBcAg),虽来源于同一病毒,但仅与其相应的抗体结合,而不与另外两种抗体反应。抗原抗体反应的这种特异性使免疫测定能在一非常复杂的蛋白质化合物(例如血清)中测定某一特定的物质,而不需先分离待检物。
  但是这种特异性也不是绝对的。假使两种化合物有着部分相同的结构,在抗原抗体反应中可出现交叉反应。例如:绒毛膜促性腺激素(hCG)和黄体生成激素(LH)均由α和β两个亚单位组成,其结构的不同处在β亚单位,而两者的α亚单位是同类的。用hCG免疫动物所得的抗血清中含有抗α-hCG和抗β-hCG两种抗体,抗α-hCG抗体将与LH发生交叉反应。在临床检验中,如用抗hCG抗血清作为妊娠诊断试剂检定尿液中hCG,只能用于hCG浓度较高的试验,否则妇女生理性排泄入尿液中的微量LH将与之发生交叉反应。因此在作为早孕诊断(敏感度应达到50mIu/mlhCG)的实际中必须应用只对hCG特异的抗β-hCG,以避免与其它激素的交叉反应的发生。
1.3.4 敏感性  在测定血清中某一物质的含量时,化学比色法的敏感度为mg/ml水平,酶反应测定法的敏感度约为5~10μg/ml,免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿。标记的免疫测定的敏感度可提高数千倍,达ng/ml水平。例如,用放射免疫测定法或酶免疫测定法测定HBsAg,其敏感度可达0.1ng/ml。
1.4 免疫测定在临床检验中的应用
  由于各种抗原成份,包括小分子的半抗原,均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体,利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原,因此免疫测定的应用范围极广,在临床检验中可用于测定:
    1) 体液中的各种蛋白质,包括含量极少的蛋白质如甲胎蛋白等。
    2) 激素,包括小分子量的甾体激素等。
    3) 抗生素和药物。
    4) 病原体抗原,HBsAg、HBeAg等。
    5) 另外,也可利用纯化的抗原检测标本中的抗体,例如抗-HBs等。
1.5. 标记的免疫测定
  如上所述,免疫测定是一种很敏感的测定方法,抗原抗体反应后直接测定形成的沉淀或浊度,敏感度可达5~10μg/ml,但在临床检验中,某些待测物在标本中的含量远低于这一水平,因此要寻找增加敏感度的方法。标记的免疫测定是将检测试剂中的抗原或抗体用可微量测定的物质加以标记,通过测定标记物来提高敏感度。在放射免疫测定和酶免疫测定中,标记物分别为放射性核素和酶,最后用测定放射性和酶活力来计算待检物的量,敏感度可比直接测定沉淀物提高数百至数千倍。在标记免疫测定中,一般加入过量的标记试剂以保证与待测物彻底反应。以标记抗体(Ab※)检测抗原(Ag)为例,反应式如下:Ag+ Ab※ → AgAb※+ Ab※。在反应产物中有与Ag结合的Ab※和游离和Ab※,如不将两者分离而测定标记物,测得的结果将为两者之和。因此,游离标记物与结合标记物的分离是标记免疫测定中的重要步骤。可采用多种手段,固相载体是其中之一。如将抗原或抗体包被在固相载体上,然后再与标记的抗原或抗体直接反应,结合的标记物被固定在载体上,而游离的标记物留于溶液中。这样可以通过洗涤将游离的Ab※除去,结合标记物的测定可在固相上进行。

常见的免疫检测技术回目录

(一)皮内试验 (intrader rpmal test,ID) 宿主在病原体刺激后,体内产生亲细胞性抗体(IgE和IgG4)。当其与相应抗原结合后,肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒,释放生物活性物质,引起注射抗原的局部皮肤出现皮丘及红晕,以此便可判断体内是否某有种特异性抗体存在。
(二)免疫扩散(immunodiffusion)和免疫电泳(immunoelectrophoresis)
1.免疫扩散 于一定条件下,抗原与抗体在琼脂凝胶中相遇,在二者含量比例合适时形成肉眼可见的白色沉淀。本法有两种类型:①单相免疫扩散:将一定量的抗体混入琼脂凝胶中,使抗原溶液在凝胶中扩散而形成沉淀环,其大小与抗原量成正比;②双相免疫扩散:将抗原与抗体分别置于凝胶板的相对位置,二者可自由扩散并在中间形成沉淀线。用双相免疫扩散法既可用已知抗原检测未知抗体,也可用已知抗体检测未知抗原。
2.免疫电泳 是将免疫扩散与蛋白质凝胶电泳相结合的一项技术。事先将抗原在凝胶板中电泳,之后在凝胶槽中加入相应抗体,抗原和抗体双相扩散后,在比例合适的位置,产生肉眼可见的弧形沉淀线。
(三)间接红细胞凝集试验(indirect haemagglutination test,IHA) 以红细胞作为可溶性抗原的载体并使之致敏。致敏的红细胞与特异性抗体结合而产生凝集,抗原与抗体间的特异性反应即由此而显现。常用的红细胞为绵羊或O型人红细胞。
(四)间接荧光抗体试验 (indirect fluorescent antibody method,IFA)
vvv 本法用荧光素(异硫氰基荧光素)标记第二抗体,可以进行多种特异性抗原抗体反应,即可检测抗原又可检测抗体。本法具有较高的敏感性、特异性和重现性等优点,除可用于寄生虫病的快速诊断,流行病学调查和疫情监测外,还可用于组织切片中抗原定位以及在细胞和亚细胞水平观察和鉴定抗原、抗体和免疫复合物。
(五)对流免疫电流试验 (counter-immunoelectrophoresis,CIE) 对流免疫电泳试验是以琼脂或琼脂糖凝胶为基质的一种快速,敏感的电泳技术。既可用已知抗原检测抗体,又可用已知抗体检测抗原。反应结果可信度高,适用范围广。以本法为基础改进的技术有酶标记抗原对流免疫电泳(enzyme-linked antigen counterimmunoelectrophoresis,ELACIE )和放射对流免疫电泳自显影(radio-immuno-counterelectrophoretic autography,RCIEPA)等技术。二者克服了电泳技术本身不够灵敏的弱点。
(六)酶联免疫吸附试验 (enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)
vvv 酶联免疫吸附试验原理是将抗原或抗体与底物(酶)结合,使其保持免疫反应和酶的活性。把标记的抗原或抗体与包被于固相载体上的配体结合,再使之与相应的无色底物作用而显示颜色,根据显色深浅程度目测或用酶标仪测定OD值判定结果。
(七)免疫酶染色试验 (immunoenzyme staining test,IEST) 免疫酶染色试验以含寄生虫病原的组织切片、印片或培养物涂片为固相抗原,当其与待测标本中的特异性抗体结合后,可再与酶标记的第二抗体反应形成酶标记免疫复合物,后者可与酶的相应底物作用而出现肉眼或光镜下可见的呈色反应。
(八)免疫印迹试验(immunobloting technique,ELIB) 免疫印迹试验又称免疫印渍或western blot,是由十二烷基硫酸钠-聚丙烯酸胺凝胶电泳(SDS-PAGE),电转印及固相酶免疫试验三项技术结合为一体的一种特殊的分析检测技术。本法具有高度敏感性和特异性。

免疫酶检测技术回目录

(一) 原理 
免疫酶技术是近代发展起来的一项新的免疫技术。它是把抗原抗体的免疫学反应与酶的高效催化作用原理有机地结合起来,即把具有催化活性的酶类通过化学的方法和抗体(或抗原)结合起来成为酶标记物。这种酶标记物同时具有免疫学反应性和化学反应性,将其与待测的抗原或抗体结合,通过酶的活性降解底物呈现出颜色反应从而显示出该免疫学反应的存在。酶的活性与底物以及与显色反应呈一定的比例关系。显色越深,说明酶降解底物量越大,与酶标抗体(抗原)相检测对应的抗原(或抗体)量也就越多。
(二)免疫酶的分类与特点
1.分类
 
2.免疫酶技术的特点
⑴ 灵敏度高,可与放射免疫相比,检测能力可达ng水平。
⑵ 应用范围广,既能检测抗体又能检测抗原,既能定性又能定量、定位及抗原分析。
免疫荧光技术、放射免疫技术和免疫酶技术的应用比较见表12-1
表12-1免疫酶技术、免疫荧光和放射免疫技术的比较
 定性 定量 定位 抗原分析
免疫荧光技术 + - + -
免疫酶技术 + + + +
放射免疫技术 + + + -
⑶ 不需要特殊设备,放射免疫需要特殊的实验室条件,免疫荧光法需要荧光显微镜。
⑷ 标本可长期保存。
⑸ 酶标记物有效时间较长,一般低温保存可达一年以上。
(三)常用标记酶及其底物
1.标记酶的选择条件
⑴ 活性高,分解底物的能力强。
⑵ 特异性强,即作用于底物的专一性强。
⑶ 与抗原抗体结合后仍保持酶的活性。
⑷ 与底物作用可以显色。
⑸ 纯度高、易纯化,即含杂蛋白少。
⑹ 可溶性(水溶性)好,在溶液中稳定。
⑺ 测定方法简单。
⑻ 酶来源方便、价格低廉。
2.符合条件的酶
⑴ 辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase HRP),分子量40 000。
⑵ 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase AKP),分子量82 000。
⑶ β-半乳糖甙酶(β-galactosidase),分子量540 000。
⑷ 葡萄糖氧化酶(glucose oxidase),分子量186 000。
其中以HRP最为常用,因其具有活力高、稳定、分子量小、易提纯等优点。
3.辣根过氧化物酶  HRP广泛地分布于植物界,以辣根中含量最高。它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉辅基组成的一种糖蛋白,含糖量18%,它由300个氨基酸和4个二硫键连接而成。分子量40 000,等电点5.5~9.0之间,它催化的最适pH因供氢体不同而有所差异,但多在pH5.0左右。HRP易溶于水和58%以下的饱和硫酸铵溶液。
HRP酶蛋白和其它杂蛋白的最大吸收光谱为275nm,辅基部分的最大吸收光谱为403nm,二者比值OD403/OD275为酶的纯度。以RZ值(Reinheit Zabl德文)表示。RZ>3为高质量,RZ>2.5为中等质量,RZ<2.5则需要纯化。RZ值越小,表示杂蛋白越多,如RZ为0.6,则表示有75%的杂蛋白。
衡量酶质量的标准有两条,一个是纯度即RZ值,一个是活力。只用酶的纯度表示是不全面的。目前国际上规定,酶的活力以国际单位表示。一个酶单位是在一定的条件下(pH、温度和底物浓度)一分钟能降解1mMol/L底物的酶活力。1mg酶所含有酶的单位数称为比活性。用比活性进行酶的比较。
用作标记的过氧化物酶活性一般要大于250units/mg。
4.HRP的作用底物与供氢体  底物为H2O2,催化时需供氢体。
⑴ 组化法常用的供氢体是3,3′-二氨基联苯胺盐酸盐(3.3-diamino-benzidine . DAB)。其反应物由于形成的氧化型中间体迅速聚合,形成不溶性的棕色吩嗪衍生物,可用于光学显微镜观察。这种多聚物能还原和螯合四氧化锇(OSO4)形成具有电子密度的产物,可适用于电子显微镜观察。
⑵ 用于ELISA的供氢体有下列数种。
表  ELISA的供氢体
供  氢  体 反应颜色 波长 终止剂 终止
颜色 测定波长
联大茴香胺(OD) 桔红 512 5Mol/L HCI 黄 400
邻苯二胺(OPD) 黄 444 2Mol/L H2SO4 桔黄 492
邻苯甲苯胺(OT) 兰 636 2Mol/L H2SO4 黄 442
5-氨基水杨酸 褐 475 1Mol/L NaOH 褐 449
以OD和OPD最为常用。OPD有致癌作用,使用时需注意。
5.碱性磷酸酶  可从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取。它是一种磷酸脂酶,其作用是催化磷酸-脂水解释放出无机磷酸而显色。或者通过水解产生的磷酸与钼酸反应生成磷钼酸,然后在还原剂作用下生成蓝色的产物进行测定。

D 酶标记抗体的制备
(一)酶标抗体的条件
1.纯度高、含杂蛋白少,用IgG优于血清抗体,用Fab优于IgG。
2.特异性强 即抗IgG与IgG在免疫电泳上只有一条沉淀线,与IgG的全血清也只有一条沉淀线,这才算是特异性的单价抗体。
3.效价高 一般琼脂扩散鉴定为1︰64以上才算合格。
(二)酶标记方法
1.交联法  交联法通常用的交联剂是戊二醛,戊二醛商品大多为25%的水溶液,利用戊二醛分子上对称的两个醛基,分别与酶和蛋白质分子中游离的氨基、酚基等以共价键结合而进行标记。标记时应尽量采用新鲜纯品,当戌二醛的OD235nm/OD280nm<3时,即为好的交联剂。
戊二醛交联法又分为一步法和二步法。
⑴ 一步法:即把酶、戊二醛和抗体一起加入进行交联。然后透析出过量的戊二醛而制备出具有高分子量的酶结合物。由于抗体分子量大(16万),酶分子量小(4万),抗体分子的氨基数比酶蛋白分子氨基数多得多,结果生成的抗体-戊二醛或抗体-戊二醛-抗体多而造成酶标物的活性小。一步法操作:①抗IgG-AKP的制备:将10mgAKP溶于含有5mg抗IgG的1mlPBS(0.01Mol/L pH7.0)中,在冰浴中缓缓搅拌,尽量避免气泡产生,完全溶解后,缓缓滴加1%戊二醛溶液4ml,使戊二醛的最终浓度为0.2%,移至室温中静置2h~3h后,以0.01Mol/L pH7.0 PBS液4℃充分透析或以SephadexG25柱除去过量的戊二醛,4℃保存备用(也可保存于50%甘油中置低温冰箱);②抗IgG-HRP的制备:将12mgHRP溶于含5mg抗IgG的1mlPBS(0.1Mol/L pH6.8)中,缓慢搅拌下加入1%戊二醛溶液4mL,置室温2h~3h,充分透析或以SephadexG25除戊二醛,小量分装后保存于低温冰箱,避免反复冻融。或冷冻干燥保存。
⑵ 二步法:是先使酶与戊二醛反应,除去未反应的戊二醛,再使已“活化”的酶分子与抗体分子的氨基结合,最后加入少量的赖氨酸封闭被戊二醛激活的酶的残基。二步法操作:将10mg的酶溶于0.2ml含1.25%戊二醛的0.1mol/L pH6.8 PBS中室温放置18h,充分透析或以SephadexG25柱除去未反应的戊二醛。加生理盐水至1ml然后加入1ml(含5mg)的抗体溶液和1ml 1Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液,混合后4℃冰箱放置24h,加入0.1ml 0.2mol/L赖氨酸,置室温2h,以0.15Mol/L pH7.2 PBS液充分透析,离心去沉淀,上清液即为酶结合物,再进一步以硫酸铵沉淀纯化后应用。AKP一般不采用二步法,而只用一步法。
改良HRP二步标记法:取HRP10mg溶于0.4ml,0.25Mol/L pH6.8PBS液中或0.05Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液中,加入25%戊二醛0.1ml,37℃温育2h后加入冰冷的分析纯的无水乙醇2ml,2 500r/min离心沉淀10min~15min,倾去溶液。沉淀以80%乙醇4ml~5ml混悬,同上离心,倾去乙醇,将管倒置,使乙醇充分流出。沉淀用1ml 0.05Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液溶解,加入0.5ml~1ml 抗IgG抗体溶液(含抗体15mg左右),放在冰箱内过夜后,加KH2 PO4,使近中性即可应用。
2.氧化法  采用过碘酸钠,过碘酸钠是强氧化剂,能将HRP的甘露糖部分(与酶活性无关的部分)的羟基氧化成醛基,然后与抗体的氨基结合,形成酶标抗体。
(1)氧化法操作过程如下:将5mgHRP溶于新配制的1ml 0.30Mol/LpH8.1重碳酸钠中,加0.1 ml 1%氟二硝基苯(FDNB)无水乙醇溶液,在室温中混合后,再加入1ml 0.04Mol/L~0.08Mol/L过碘酸钠(NaIO4),置室温中轻搅30min,在溶液呈黄绿色时,加1ml 0.16Mol/L乙二醇溶液,在室温中放置1h,使氧化反应中止,然后在4℃中对0.10Mol/L pH 9.5重碳酸钠缓冲液透析,换液3次。在3ml HRP-醛基溶液中,加入5mg(溶于1ml的碳酸盐缓冲液中),室温置2h~3h,加入5mg氢化硼钠(NaBH4),于4℃冰箱放置3h或过夜,然后用PBS液充分透析,离心去沉淀物。上清液即为酶结合物,纯化后使用。
(2)改良过碘酸钠法:①取5mg HRP溶于0.5ml双馏水中,加入新配制的0.06Mol/L NaIO4水溶液(10ml双馏水+128mg NaIO4) 0.5ml,混匀,置4℃30min;② 取出后加入0.16Mol/L乙二醇水溶液(10mlH2O+0.09ml乙二醇)0.5ml,室温放置30min;③加入含5mg纯化抗体的水溶液1ml,混匀,并装入透析袋,对0.05Mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液缓缓搅拌透析6h(或过夜),使之结合;④加入NaBH4溶液(5mg/ml)0.2ml,混匀,置4℃2h;⑤在以上溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液,混匀,4℃30min,离心,去上清,沉淀以少许0.02Mol/L pH7.4 PBS液溶解,装入透析袋,以同样液体在4℃透析除盐过夜;⑥次日取出离心,以除去不溶物,即得酶-抗体(HRP-IgG)结合物,以0.02Mol/L pH 7.4 PBS液加至5ml;⑦效价测定合格后,加入等量优质甘油,分装小瓶,低温保存。
表  戊二醛法与过碘酸钠法比较
比较项目
 戊二醛法 过碘酸钠法

 一步法 二步法 
标记方法 简单 较复杂 较复杂
酶利用率 2~4% 2~4% 70%酶偶联到99%抗体上
产率 <5% <5% >50%
标记抗体分子量 750万 <25万 >40万
穿入组织能力 差 好 一般
抗体活性丢失 多 少 较多
酶活性丢失 多 少 较多
染色效应 差 较好 较好
3.二马来酰亚胺法  二马来酰亚胺(Dimaleimide)能与蛋白质半胱氨酸的硫基反应。首先用α-巯基乙胺还原蛋白质(IgG),并用N、N‘-O-苯二马来酰亚胺活化,然后除去多余的试剂,最后使含二马来酰IgG与含硫基的β-半乳糖苷酶连接。具体操作如下:将抗lgG抗体溶于0.1Mol/L pH5.0醋酸钠缓冲液并对同一缓冲液透析平衡过夜,离心除去不溶性物质,抗IgG(14mg/2ml)与10mlα-巯基乙胺在37℃温育90min。过Sephadex后浓缩使每ml含3.0mg左右的还原抗IgG。在0℃中,按1︰1滴加饱和N、、N‘-O-苯二马来酰亚胺溶液,混合,于30℃温育20min,过SephadexG25柱,除去未反应的二马来酰亚胺。收集二马来酰亚胺“活化”的抗IgG,浓缩使浓度为OD280nm=1.0(光径1cm),取1ml溶液加20μl(5mg/ml)β-半乳糖苷酶,置30℃20min,用0.10Mol/L NaOH中和后,于4℃置24h~72h,再过Sepharose-6B柱(1.5×40cm),以pH7.0PBS洗脱,收集酶结合物,加叠氮钠(NaN3)防腐,4℃保存备用。
(二) 酶标抗体结合物的纯化 
在酶标记的溶液中,出现的是各种交联物的混合物,有酶-抗体、酶-抗体-酶、抗体-抗体、酶-酶,甚至还有游离的酶和抗体。在这中间,除了抗体-酶和酶-抗体-酶外,其它都应该给予除去。
1.50%饱和硫酸铵沉淀法。 此法只能除去游离的酶及酶-酶聚合体。而不能除去其它不需要者。但是此法对酶标抗体的损耗少。
2.过SephadexG200或Sepharose-6B柱。此法较繁琐,而且对酶标抗体的损耗较大,但提纯的质量好。
(三)酶标抗体的鉴定
1.酶标抗体的活性鉴定  一般以琼脂扩散和免疫电泳进行鉴定。使酶标抗体和相应的抗原(抗原浓度为1mg/ml)产生沉淀线,洗涤后于底物溶液中显色,显色后用生理盐水漂洗,沉淀线不褪色,说明酶和抗体都具有活性。良好的酶标结合物琼脂扩散滴度一般应在1:16以上。
2.酶结合物的定量测定  包括酶量、IgG含量、酶与IgG克分子比值以及结合率的测定。
酶量(µg/ml)=OD403nm×0.42     
(1)戊二醛法:IgG(mg/ml)=(OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62
(OD403×0.42为酶在403nm的光密度,抗体与酶-戊二醛结合后OD280nm约增加6%,所以乘以0.94校正。由于兔IgGOD280nm=1.0时为0.62mg,所以又乘以0.62)。
(2)过碘酸钠法:IgG(mg/ml)=(OD280-OD403×0.30)×0.62
 
(40 000和160 000分别为辣根过氧化物酶和IgG的分子量)。
⑷ 酶结合率=结合物中的酶量/标记时加入的酶量×100%。
⑸ 酶标记率:OD403nm/OD280nm即酶中正铁血红素辅基的吸光度(403nm)与抗体-酶蛋白中的色氨酸、酪氨酸的吸光度(280nm)之比表示HRP在AbE中所占的比例,它与E/Ab克分子比值呈高度正相关。
3.酶结合物的质量标准  纯化的酶结合物的质量标准应包括以下几个方面。
(1)酶的催化活性。
(2)免疫学活性。
(3)未联接的游离酶的量。
(4)未联接的原始免疫反应物的量。
(5)每个酶分子所联接的免疫反应物分子数目。
(6)生化性质。
(7)酶标记免疫试验效果。
酶结合物的质量差异,可引起试验敏感度的很大变化。例如用不同的程序制得的HRP-IgG结合物进行酶标记免疫试验,可得到不同的试验结果,故应予重视。
  表 用于ELISA酶标抗体的各项指标参数
评价 最好 好 一般
酶结合量(mg/ml) ≥1.0 ≥0.5 0.4
酶结合率(%) >30 9~10 7
酶IgG克分子比 >1.5 1.0 0.7
(五)酶标抗体的保存
分装小瓶,冻干低温保存。也可分装小瓶,在4℃或0℃以下保存。加甘油或牛血清白蛋白(最后浓度为33%)保存更好。避免反复冻融。保存期:一般1~2年活性不变。

E 抗酶抗体及酶-抗酶复合物的制备
抗酶抗体的优点,在于酶和抗体结合时,不需要通过化学交联剂交联,抗体的失活少。在酶复合物形成后,同时就具有酶的活性,遇到相应的底物即呈现催化显色作用。必须注意,抗酶抗体必须用与第一抗体同种来源的动物制备。
(一)抗酶抗体的制备
于家兔的两个后足掌内各注入弗氏完全佐剂(含活卡介苗12mg/ml)和过氧化物(5mg/ml)
的等量混合乳化液0.5ml,两星期后,于两侧腘淋巴结内注入同样液体。一周后静脉注射0.2ml~0.4ml,过氧化物酶液(同样浓度), 并同样强化2-3次,末次注射后一周验血、分离血清即为过氧化物酶抗体。
(二)酶-抗酶复合物(PAP)的制备
1.取单价特异性抗酶血清10ml,1.5×104r/min(4℃)离心20min,吸取上清。
2.于上清液中滴加酶溶液(0.5mg/ml)直至不再产生沉淀,静置1h,1.5×104r/min离心20min。
3.将沉淀物用冷生理盐水125ml洗三次,每次1.5×104r/min离心20min。
4.于冰浴下,将沉淀物悬混于4ml HRP(2mg/ml)中。
5.在pH计监测下,边搅拌边加0.1Mol/L或0.01Mol/L HCl至pH 2.3。此时沉淀已全部溶解,1.5×104r/min离心20min。
6.吸取上清,用0.1Mol/L NaOH调pH至7.4。
7.量体积,加入1/10容量的0.075Mol/L醋酸钠和0.15Mol/L醋酸铵的等量混合液。
8.逐滴加入等体积的100%饱和硫酸铵,搅拌20min。1.5×104r/min离心20min。
9.将沉淀物用50%饱和硫酸铵洗1次,同样离心。
10.将沉淀物悬混于5ml蒸馏水中,以pH6.75缓冲盐水透析3天,每天换水1次。(缓冲盐水由1.35×104ml生理盐水, 25ml 1.5Mol/L醋酸钠和75ml 2Mol/L醋酸铵配成)。
11.1.5×104r/min(4℃)离心20min,吸取上清,于OD280nm和OD403nm测定,计算IgG和酶含量及克分子比值。
12.按0.1ml分装,-20℃保存。
13.应用时从低温冰箱中取出,立即在37℃水浴中融化。

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