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地高辛配基随机标记DNA探针

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1.标记DNA探针 每次标准的反应可标记10ng至3?线性的DNA,也可标记更大量的DNA,但所有的成分和体积要相应增加。

(1)DNA探针热变性,煮沸10min,迅速冷却于冰/乙醇中5min以上,待用。

(2)取Eppendorf管(1.5ml)置于冰上,加下列及试剂:

新鲜变性的DNA 1-3?

六聚核苷酸混合物 2?(管5)

dNTP标记用混合底物 2?(管6)

加无菌重蒸水至 19?

DNA聚合酶Ⅰ大片段(Klenow) 1?(管7)

(3)在37℃保温至少60min,可到20h。

(4)煮沸5min,终止反应。

(5)15000rpm离心30s,置于冰上待用。

2.预杂交 按100cm2膜用20~40ml预杂交溶液,预杂交时使溶液处于流动状态。

预杂交液组成:5?SC

0.5%(W/V)封阻试剂(管11)

0.1%(W/V)N-十二烷酰肌氨酸钠

0.02%(W/V)SDS

膜放入塑料袋,灌入预杂交液,排除气体后密封,在65℃预杂交过夜。

3.杂交 按100cm2膜用2.5ml杂交液,杂交时偶尔摇动杂交袋,使里面的溶液重新分配。

杂交液组成: 50%甲酰胺(V/V)

5%(W/V)封阻试剂

5?SC

0.1(W/V)N-十二烷酰肌氨酸钠

0.02%(W/V)SDS

新变性标记DNA(150ng/ml)

杂交液取代预杂交液,替换间膜不能干,成功地替换应是膜与塑料袋间形成一层杂交液膜。于42℃杂交过夜(16~20h)。

4.洗膜 按100cm2膜用250ml洗膜液计算。

(1)在室温下用2?SC/0.1%(W/V)SDS溶液漂洗,5min,2次。

(2)在65℃条件下用0.1?SC/0.1%SDS溶液漂洗,10min,2次。

(3)在室温下用2?SC溶液漂洗1次。

5.免疫测定

(1)配制溶液

缓冲液1:Tris-HCl(100mmol/L);NaCl(150mmol/L)pH7.5(20℃)

缓冲液2:0.5%(W/V)封阻试剂(管11),配制于缓冲液1中(封阻试剂不会快速溶解,因此应预早1h前配制此溶液,将试剂溶于50~70℃,此溶液保持混浊)。

缓冲液3:Tris-HCI(100mmol/L);NaCI(100mmol/L);MgCI2(500mmol/L)pH9.5(20℃)。

缓冲液4:Tris-HCl(10mmol/l);EDTA(1mmol/L);pH8.0(20℃)

显色溶液:新鲜配制,在10ml缓冲液3中,加45?NBT溶液(管9)和35?X-磷酸盐缓冲液(管10)。

2. 显色过程

A.膜在缓冲液1中短暂洗涤(1min)。

B.在100ml缓冲2中保温30min。

C.再用缓冲液1短暂洗涤。

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