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实验步骤
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实验原理
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| 1 |
挑取一个JM109单菌落于3ml LB(无抗生素)培养基中，37℃，180rpm培养过夜。 |
让菌复苏，进入对数期的早中期。此时更容易制得感受态细胞。 |
| 2 |
取0.4mL过夜培养物加入到40mL LB(无抗生素)培养基中，37℃250rpm大约2.5小时）。 |
减少达到所需亮的均所需繁殖的世代数，以减少菌的变异。 |
| 3 |
取培养物置于40mL的灭菌离心管中，冰浴10min，4000rpm 4℃离心10min，弃上清。（将所有上清倒光，可以将离心管倒过来） |
使细菌的生长停止，代谢减慢。因为这时已经没有培养基了，如果细菌仍有很高的代谢效率，则有大量细菌死亡。 |
| 4 |
菌体重悬于10mL 100mmol/L冰冷CaCl2 中，轻吹，4℃ 30min，4000rpm离心5min弃上清。
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细菌处于00C，CaCl2 低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面（羟基来源于细胞壁上的糖，磷酸来源于DNA
），经短时间420C热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）
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| 5 |
菌体重悬于1mL 100mmol/L冰冷的CaCl2 中，轻吹，用于转化。 |
除去所有的LB以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。防止细胞分裂，以致大量细胞死亡。（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱） |
| 6 |
取感受态细胞100uL，加入2uLpET-21a质粒，冰浴30 min受体菌：感受态细胞100uL，加入2 uL无菌双蒸水阴性对照：0.1mol/LCaCl2溶液100uL，加入2 uL阴性对照 |
第一个阴性对照是为了验证LB中的抗生素有活性；第二个阴性对照是为了验证CaCl2 溶液和pET-21a质粒未被污染。 冰浴是为了降低细胞代谢率，防止细胞大量死亡。 |
| 7 |
热激 42oC，90s |
在低温处理后，热激，可以使细胞壁热胀冷缩，再低温，使细胞壁上黏附的质粒进入细胞体内。 |
| 8 |
冰浴2 min |
| 9 |
加入800 uL 无抗生素的 LB，37℃复苏1h |
用LB复苏细胞，使细胞恢复活力，从而使细胞中的质粒表达抗抗生素的基因，只有这样才能使转化成功的细菌在有抗生素的LB平板上生长。 |
| 10 |
取100ul细胞直接在含50ug/mL Carbenicillin(羧苄西林)的LB培养基上铺平板，将平皿放置37 oC温箱30min至液体被吸收。倒置平皿37 oC培养过夜，出现菌落。 |
这些菌落为转化成功的菌落，而对照组应该没有菌落。在目的菌落的旁边有可能出现卫星菌落，这是因为亩的菌落的抗性基因似的菌落周围的抗生素失效，长出了转化为成功的菌落。用羧苄西林因其对酸稳定、不易被细菌降解，所以可以降低卫星菌落的数量。 因为抗生素高温易失活，所以应等到LB600C时（热而不烫），加入抗生素。 |
