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质粒载体

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质粒(plasmid)是细菌或细胞染色质以外的,能自主复制的,与细菌或细胞共生的遗传成分。其特点如下:

①是染色质外的双链共价闭合环形DNA(covalentlyclosed circuar DNA,cccDNA),可自然形成超螺旋结构,不同质粒大小在2-300kb之间,<15kb的小质粒比较容易分离纯化,>15kb的大质粒则不易提取。

②能自主复制,是能独立复制的复制子(autonomous replicon)。一般质粒DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂而传给后代。按质粒复制的调控及其拷贝数可分两类:严紧控制(stringent control)型质粒的复制常与宿主的繁殖偶联,拷贝数较少,每个细胞中只有1个到十几个拷贝;另一类是松弛控制(relaxed control)型质粒,其复制宿主不偶联,每个细胞中有几十到几百个拷贝。每个质粒DNA上都有复制的起点,只有ori能被宿主细胞复制蛋白质识别的质粒才能在该种细胞中复制,不同质粒复制控制状况主要与复制起点的序列结构相关。有的质粒的可以整合到宿主细胞染色质DNA中,随宿主DNA复制,称为附加体,例如细菌的性质粒就是一种附加体,它可以质粒形式存在,也能整合入细菌的DNA,又能从细菌染色质DNA上切下来。F因子携带基因编码的蛋白质能使两个细菌间形成纤毛状细管连接的接合(conjugation),通过这细管遗传物质可在两个细菌间传递。

③质粒对宿主生存并不是必需的。这点不同于线粒体,线粒体DNA也是环状双链分子,也有独立复制的调控,但线粒体的功能是细胞生存所必需的。线粒体是细胞的一部分,质粒也往往有其表型,其表现不是宿主生存所必需的,但也不妨碍宿主的生存。某些质粒携带的基因功能有利于宿主细胞的特定条件下生存,例如,细菌中许多天然的质粒带有抗药性基因,如编码合成能分解破坏四环素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因,这种质粒称为抗药性质粒,又称R质粒,带有R质粒的细菌就能在相应的抗生素存在生存繁殖。所以质粒对宿主不是寄生的,而是共生的。医学上遇到许多细菌的抗药性,常与R质粒在细菌间的传播有关,F质粒就能促使这种传递。

pBR322及pUC18图谱


图20-2 pBR322及pUC18图谱

现在分子生物学使用的质粒载体都已不是原来细菌或细胞中天然存在的质粒,而是经过了许多的人工的改造。从不同的实验目的出发,人们设计了各种不同的类型的质粒载体,近年来发展很快,新的有特定用途的质粒不断被创建。图20-2给出最常用的大肠杆菌克隆用质粒pUC19的图谱,此质粒的复制起点处序列经过改造,能高频率起动质粒复制,使一个细菌pUC19的拷贝数可达500-700个;质粒携带一个抗氨芐青霉素基因,编码能水解β-内酰胺环,从而被坏氨芐青霉素的酶,当用pUC19转化细菌后放入含氨芐青霉素的培养基中,凡不含pUC19者都不能生长,结果长出的细菌就是都含有pUC19的;pUC19还携带细菌lac操纵元中的lacI和lacZ基因编码,β-半乳糖苷酶N端状146个氨基酸的段落,当培养基中含有诱导物IPTG和Xgal时,lacz ' 基因被诱导表达产生的β-半乳糖苷酶N端肽与宿主菌表达的C端肽互补而具有β-半乳糖苷酶活性(质粒和宿主编码的肽段各自都没有酶活性,两都融为一体而具酶活性,称为α-互补,α-complementation),半乳糖苷酶水解Xgal而使菌落呈现蓝色;在lacz '中间又插入了一段人工设计合成的DNA序列,其中密集多个常用的限制性核酸内切酶的位点,使外来的基因和序列能很方便地被插入此位置,当外来序列插入后则破坏了lacz '编码的半乳糖苷酶活性,生长的菌落就呈白色,这种颜色标志的变化就很容易区分和挑选含有和不含有插入序列或基因的转化菌落,称为蓝白筛选法。

除常用的大肠杆菌质粒载体外,近年来发展了许多人工构建的其它能用于微生物、酵母、植物等的质粒载体。含有不止一个ori、能携带插入序列在不同种类宿主细胞中繁殖的载体称为穿梭载体(shuttlevectors)。

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