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各种显微镜检术介绍

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第一节 金相显微镜
前面讲述了显微镜的光学原理以及附件,下面将分类介绍一下各类研究用镜检术。在材料研究领域,反射式明场显微镜得到广泛应用,在此基础上各种特殊的镜检方法也得到应用,如暗场,偏光,相衬,干涉,荧光,这些镜检方法在高档显微镜上均能同时实现。
一. 明视野观察(Bright field)
 明视野镜检是大家比较熟悉的一种镜检方式,广泛应用于病理、检验,用于观察被染色的切    片,所有显微镜均能完成此功能。在此不再赘述。
二. 暗视野观察(Dark field)
暗视野实际是暗场照明。它的特点和明视野不同,不直接观察到照明的光线,而观察到的是被检物体反射或衍射的光线。因此,视场成为黑暗的背景,而被检物体则呈现明亮的像。暗视野的原理是根据光学上的丁道尔现像,微尘在强光直射通过的情况下,人眼不能观察,这是因为强光绕射造成的。若把光线斜射它,由于光的反射,微粒似乎增大了体积,为人眼可见。暗视野观察所需要的特殊附件是暗视野聚光镜。它的特点是不让光束由下至上的通过被检物体,而是将光线改变途径,使其斜射向被检物体,使照明光线不直接进入物镜,利用被检物体表面反射或衍射的光形成明亮图像。暗视野观察的分辨率远高于明视野观察,最高达0.02—0.004mm。
三.相衬镜检法(Phase contrast)
在光学显微镜的发展过程中,相衬镜检术的发明成功,是近代显微镜技术中的重要成就。我们知道,人眼只能区分光波的波长(颜色)和振幅(亮度),对于无色通明的生物标本,当光线通过时,波长和振幅变化不大,在明场观察时很难观察到标本。
相衬显微镜利用被检物体的光程之差进行镜检,也就是有效地利用光的干涉现像,将人眼不可分辨的相位差变为可分辨的振幅差,即使是无色透明的物质也可成为清晰可见。这大大便利了活体细胞的观察,因此相衬镜检法广泛应用于倒置显微镜。
1. 相衬镜检法在装置上与明场不同,有一些特殊要求:
( 1 ). 环状光阑(Ring slit): 装在聚光镜的下方,而与聚光镜组合为一体——相衬聚光镜。它是由大小不同的环形光阑装在一圆盘内,外面标有10X、20X、40X、100X等字样,与相对应倍数的物镜配合使用。
( 2 ). 相板(Phase plate): 装在物镜的后焦平面处,它分为两部分,一是通过直射光的部分,为半透明的环状,叫共轭面;另一是通过衍射光的部分,叫“补偿面”。有相板的物镜称“相衬物镜”,外壳上常有“Ph”字样。
2. 相衬镜检法是一种比较复杂的镜检方法,想要得到好的观察效果,显微镜的调试非常重要。除此之外还应注意以下几个方面。
( 1 ). 光源要强,全部开启孔径光阑;
( 2 ). 使用滤色片,使光波近于单色;
四.微分干涉相衬镜检术(Differential interference contrast DIC)
微分干涉相衬镜检术出现于60年代,它不仅能观察无色透明的物体,而且图像呈现出浮雕壮的立体感,并具有相衬镜检术所不能达到的某些优点,观察效果更为逼真。
1. 原理
微分干涉相衬镜检术是利用特制的渥拉斯顿棱镜来分解光束。分裂出来的光束的振动方向相互垂直且强度相等,光束分别在距离很近的两点上通过被检物体,在相位上略有差别。由于两光束的裂距极小,而不出现重影现像,使图像呈现出立体的三维感觉。
2. 微分干涉相衬镜检术所需的特殊部件:
(1) 起偏镜
(2) 检偏镜
(3) 渥拉斯顿棱镜2 块
3. 微分干涉镜检时的注意事项
(1)因微分干涉相衬灵敏度高,制片表面不能有污物和灰尘。
(2)具有双折射性的物质,不能达到微分干涉相衬镜检的效果。
(3)倒置显微镜应用微分干涉相衬时,不能用塑料培养皿。
五 . 荧光镜检术
荧光镜检术是用短波长的光线照射用荧光素染色过的被检物体,使之受激发后而产生长波长的荧光,然后观察。荧光镜检术广泛应用于生物,医学等领域。
1.荧光镜检术一般分为透射和落射式两种类型。
(1)透射式:激发光来自被检物体的下方,聚光镜为暗视野聚光镜,使激发光不进入物镜,而使荧光进入物镜。它在低倍情况下明亮,而高倍则暗,在油浸物镜下较难操作,尤以低倍的照明范围难于确定,但能得到很暗的视野背景。透射式不适用于非透明的被检物体。
(2)落射式:透射式目前几乎被淘汰,新型的荧光显微镜多为落射式,光源来自被检物体的上方,在光路中具有分光镜,所以对透明和不透明的被检物体都适用。由于物镜起了聚光镜的作用,不仅便于操作,而且从低倍到高倍,可以实现整个视场的均匀照明。
2.荧光镜检术的注意事项
(1) 激发光长时间的照射,会发生荧光的衰减和淬灭现像,因此尽可能缩短观察时间,暂时不观察时,应用挡板遮盖激发光。
(2)作油镜观察时,应用“无荧光油”。
(3)荧光几乎都较弱,应在较暗的室内进行。
(4)电源最好装稳压器,否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命,也会影响镜检的效果。
目前许多新兴生物研究领域应用到荧光显微镜,如基因原位杂交(FISH)等等。

  第二节 偏光显微镜(Polarizing microscope )
一.偏光显微镜的特点
偏光显微镜是鉴定物质细微结构光学性质的一种显微镜。凡具有双折射的物质,在偏光显微镜下就能分辨清楚,当然这些物质也可用染色发来进行观察,但有些则不可能,而必须利用偏光显微镜。偏光显微镜的特点,就是将普通光改变为偏光进行镜检的方法,以鉴别某一物质是单折射(各向同行)或双折射性(各向异性)。双折射性是晶体的基本特性。因此,偏光显微镜被广泛地应用在矿物,化学等领域。在生物学和植物学也有应用。
二.偏光显微镜的基本原理
偏光显微镜的原理比较复杂,在此不作过多介绍,偏光显微镜必须具备以下附件(a)起偏镜 (b)检偏镜 (c)专用无应力物镜 (d)旋转载物台。
三. 偏光镜检术的方式
(一) 正相镜检(Orthscope):又称无畸变镜检,其特点是使用低倍物镜,不用伯特兰透镜(Bertrand Lens),同时为使照明孔径变小,推开聚光镜的上透镜。正相镜检用于检查物体的双折射性。
(二) 锥光镜检(Conoscope):又称干涉镜检,这种方法用于观察物体的单轴或双轴性。
四. 偏光显微镜在装置上的要求
(一) 光源:最好采用单色光,因为光的速度,折射率,和干涉现像因波长的不同而有差异。一般镜检可使用普通光。
(二) 目镜:要带有十字线的目镜。
(三) 聚光镜:为了取得平行偏光,应使用能推出上透镜的摇出式聚光镜。
(四) 伯特兰透镜:这是把物体所有造成的初级相放大为次级相的辅助透镜。
五. 偏光镜检术的要求
(一) 载物台的中心与光轴同轴。
(二) 起偏镜和检偏镜应处于正交位置。
(三) 制片不宜过薄。
第三节 体视显微镜(Stereo microscope)
体视显微镜又称“实体显微镜”或“解剖镜”,是一种具有正像立体感地目视仪器,被广泛地应用于生物学、医学、农林、工业及海洋生物各部门。它具有如下地特点:
1. 双目镜筒中的左右两光束不是平行,而是具有一定的夹角——体视角(一般为12度---15度),因此成像具有三维立体感;
2. 像是直立的,便于操作和解剖,这是由于在目镜下方的棱镜把像倒转过来的缘故;
3. 虽然放大率不如常规显微镜,但其工作距离很长
4. 焦深大,便于观察被检物体的全层。
5. 视场直径大。
目前体视镜的光学结构是:由一个共用的初级物镜,对物体成像后的两光束被两组中间物镜——变焦镜分开,并成一体视角再经各自的目镜成像,它的倍率变化是由改变中间镜组之间的距离而获得的,因此又称为“连续变倍体视显微镜”(Zoom—stereo microscope)。随着应用的要求,目前体视镜可选配丰富的选购附件,如荧光,照相,摄像,冷光源等等

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