在F-12培养基中加入5％小牛血清、10mU/ml TSH、10µg/ml胰岛素、5µg/ml转铁蛋白、10ng/ml生长抑素、0.4ng/ml氢化可的松、10ng/ml甘氨酰－组胺酰－赖氨酸醋酸盐，每100ml培养液加入1ml双抗，用200ml培养瓶置CO2孵箱35℃培养。

每4天换液一次。待细胞有80％融合时进行传代。大约7－10天传一代。

将生长状态良好、有80％融合的FRTL-5细胞弃培养液， 0.2％EDTA：0.25％胰蛋白酶1：3的消化液大约3ml加入200ml培养瓶中，待有大面积细胞脱落时，加入培养液终止消化。

用吸管轻轻吹打几下就可以成单细胞悬液。分装入两个培养瓶，传代完成，中间不需要离心。如果过早中止胰酶作用，很难吹打成单细胞悬液。