[摘要] 目的 探讨阿司匹林对人γδT细胞杀伤消化道肿瘤细胞株的影响。方法 用异戊烯焦磷酸法体外扩增人外周血γδT细胞。用不同浓度的阿司匹林诱导γδT细胞和消化道肿瘤SGC-7901、SW-1990、SW-480、SW-1116、LOVO细胞株，用MTT法检测阿司匹林对这些细胞的抑制率和用乳酸脱氢酶法测定γδT细胞的杀伤活性，用流式细胞术检测诱导前后的γδT细胞和SGC-7901、SW-1990、SW-480、SW-1116和LOVO细胞凋亡百分率。结果 γδT细胞培养10天时从扩增前4.21%增加到70.35%，CD44达94.0%。阿司匹林在3.2mmol/L时对γδT细胞的生长抑制率达41.3%，明显高于对SGC-7901、SW-1990、SW-480、SW-1116和LOVO细胞株抑制率（分别为19.6%、11.8%、9.2%、6.4%和%1.6）。0.4 mmol/L～1.6 mmol/L阿司匹林诱导24h后的γδT细胞对5种肿瘤细胞的杀伤活性最高，浓度超过3.2 mmol/L时杀伤活性呈下降趋势； SGC-7901、SW-1990、SW-480、SW-1116和LOVO细胞经不同浓度的阿司匹林诱导24h后γδT细胞对其的杀伤活性除SW-1116和LOVO细胞株略有增强外，其他组与对照组比较无明显变化。3.2 mmol/L阿司匹林对γδT细胞诱导24h的凋亡率（52.71%）显著高于SGC-7901、SW-1990、SW-480、SW-1116和LOVO细胞株(分别为7.88%、8.89%、6.21%、4.47%和%3.67)。结论：阿司匹林在临床常规使用的药物浓度时可增强γδT细胞杀伤肿瘤细胞作用，超过这一浓度可明显抑制γδT细胞的增殖能力和杀伤活性及增加γδT细胞的凋亡率，而对SGC-7901、SW-1990、SW-480、SW-1116和LOVO细胞株作用不明显。这一结果为临床阿司匹林预防消化道肿瘤的用量提供了实验依据。

[关键词] γδT细胞，培养；阿司匹林；人消化系统肿瘤SGC-7901、SW-1990、SW-480、SW-1116和LOVO细胞株

[Abstract] Objective To explore the effect of aspirin on human’s γδT cells killing digestive system tumor cell lines methods Use the isopentenyl pyrophosphate method to amplify human peripheral blood γδT cells in vitro. Various concentrations of aspirin were used to induce γδT cells and digestive system tumor cells SGC-7901,SW-1990,SW-480, SW-1116 , LOVO cells lines, MTT assays was used to detect aspirin on the inhibitory ratio of these cell lines, LDH assays was used to measure the cytotoxic activity of γδT cells , flow cytometry analysis the apoptosis percentage of before and after induced γδT cells and SGC-7901,SW-1990,SW-480, SW-1116 ,LOVO cell lines. Result γδT cells were cultivated for ten days which proliferation ratio increase from 4.21% to 70.35%,CD44 is up to 94.0%. When aspirin ´s concentrations was 3.2 mmol/L that γδT cells growth inhibitory ratio for 41.3% and which obvious higher than SGC-7901, SW-1990, SW-480, SW-1116, LOVO cell lines (respectively 19.6% 11.8% 9.2% 6.4% 1.6%). When γδT cells iduced via aspirin concentrations rang from 0.4mmol/L to 1.6 mmol/L which cytotoxic activity on the five kinds of tumor cell lines was the highest , if aspirin’s concentration surpassing 3.2mmol/L，cytotoxic activity of γδT cells present decrease tendency. SGC-7901, SW-1990, SW-480, SW-1116, LOVO cells lines were induced by different concentrations of aspirin for 24 hours, just SW-1116 and LOVO were enhanced as far as the cytotoxic activity of γδT cells on these cell lines was concerned ,other groups and control group have no notable changed. The apoptosis percentage of γδT cells(52.71%) were induced by aspirin which concentration was 3.2mmol/L ,which is strikingly higher than SGC-7901, SW-1990, SW-480, SW-1116, LOVO cells lines,(respectively 7.88%, 8.89%, 6.21%, 4.47% and 3.67%). Conclusion When aspirin ´s concentration for clinical routine used can enhance the effect of γδT cells killing the tumor cells, if surpassing this concentration can obvious inhibited the proliferation capacity and cytotoxic activity

f γδT cells and augment apoptosis ratio ,however, it is not obvious for digestive tract tumor lines. This result may offer an experiment base for applying clinical aspirin to prevent digestive tract’s tumor.

[Key words] γδT cells, cultivation, Aspirin, GC-7901、SW-1990、SW-480、SW-1116 and LOVO digestive system tumor cell lines

γδT细胞是广泛分布于消化系统、呼吸系统等粘膜和上皮组织内的固有免疫T细胞，它的抗肿瘤效应除了有与αβT细胞类似的一些功能特征外，还有识别抗原不需要MHC分子提呈、直接识别蛋白质和肽类抗原、非肽类抗原，具有抗原提呈功能和能通过细胞接触和分泌的细胞因子起免疫调节作用[1]。流行病学调查发现，长期服用非甾体类抗炎药能减少和预防消化道肿瘤的发生[2]，阿司匹林是非甾体抗炎药物的代表。为此，本实验用不同浓度的阿司匹林对人γδT细胞和5株消化系统肿瘤细胞株进行细胞抑制、细胞凋亡和γδT细胞杀伤活性的对比试验，以探讨阿司匹林是否对γδT细胞有调节作用和对人γδT细胞杀伤肿瘤细胞的影响。

1.材料与方法

1.1 材料 人胃腺癌细胞株SGC-7901，人胰腺癌细胞株SW-1990，人结肠癌细胞株SW-480、SW-1116和LOVO（上海细胞生物研究所）；胰蛋白酶、RPMI1640（Gibco公司产品）；人AB血清（徐州市血站）；胎牛血清和淋巴细胞分离液（中国科学院血液病研究所）；异戊烯焦磷酸(isopentenylpgrophosphate.IPP)、阿司匹林、四甲基偶唑篮(MTT)、二甲亚砜(DMS0)、PI染液（Sigma公司）；IL-2（厦门特宝生物公司）；抗人TCR-γδ-FITC和抗人CD44-FITC均购自杭州联科生物（Immunotech, France）；SEAC全自动酶免系列分析仪(北京希亚克技术有限公司)；流式细胞仪(美国B.D公司的FACSCaliar)，分析软件为CellQuest,每个标本分析细胞数≥1×104。

1.2 方法

1.2.1 γδT细胞的培养和鉴定 取健康献血者末梢抗凝血10mL,加入淋巴细胞分离液上，以2000r/min离心15min，吸取单个核细胞层，用生理盐水洗涤三遍（1500r/min离心，10min/次），加入RPMI 1640培养液中（含100/L小牛血清、50/L人AB血清和IPP 3mg/L），调整细胞数为1×108/L，置75┩2细胞培养瓶中，于37℃、50mL/L CO2培养箱中培养，根据细胞生长情况及时添加培养液。收集培养10d的贴壁生长细胞进行细胞表面标志检测和其他试验。

1.2.2 阿司匹林对消化系统肿瘤细胞株和γδT细胞生长的影响 将培养10d的γδT细胞和对数生长期的五种肿瘤细胞株配成1×109/L，分别接种于96孔板中，0.2mL/孔，于37℃、50mL/L CO2培养箱中培养，24h后加入阿司匹林(终浓度分别为0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.8mmol/L、1.6mmol/L、3.2mmol/L、6.4mmol/L、12.8mmol/L和25.6mmol/L)；设不加药物及无细胞的空白对照孔。继续孵育24h后每孔加人MTT液20μl，37℃孵育4h后弃上清，每孔加入DMSO 150μL，轻轻震荡10min使甲瓒充分溶解，在540nm波长酶标仪上测定各孔光吸收值(OD值)，求其平均值；同时计算细胞抑制率。

1.2.3 γδT细胞和消化系统肿瘤细胞株凋亡检测 取培养10d的γδT细胞和对数生长期SGC-7901、SW-1990、SW-480、SW-1116和LOVO细胞以每孔2×1O5个细胞接种于24孔板，用阿司匹林((终浓度分别为0.2mmol/L、0.8mmol/L、3.2mmol/L、12.8mmol/L和25.6mmol/L))诱导，每组设3个复孔。细胞经药物诱导24h后弃上清，SGC-7901、SW-1990、SW-480、SW-1116和LOVO细胞用0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞，γδT细胞直接收集，用RPMI 1640培养基洗涤3遍，加入70%冷乙醇固定，4℃过夜。PBS洗涤3次，加入PI染液(生理盐水 129.6mL，PI 10mg，RNA酶2mg，TritonX-100 1mL，枸橼酸钠200mg，加双蒸水至200mL)，4℃避光染色30min，用FCM检测，记录激发波长488nm处的红色荧光。

1.2.4 γδT细胞杀伤活性检测 取培养10d的γδT细胞和对数生长期SGC-7901、SW-1990、SW-480、SW-1116和LOVO细胞分别配成2×108/L，加入6孔细胞培养板中，每孔3mL，培养24h后加入不同浓度的阿司匹林，同时设未加药的对照组，继续孵育24h后，SGC-7901、SW-1990、SW-480、SW-1116和LOVO细胞用0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞和直接收集γδT细胞，用RPMI-1640培养基洗涤3遍，将靶细胞SGC-7901、SW-1990、SW-480、SW-1116和LOVO细胞配成2×108/L，效应细胞γδT细胞配成2×109/L的悬液，用本室建立的乳酸脱氢酶释放法[3]测定γδT细胞杀伤活性，将效靶细胞数按10:1比例混合，以500 r/ min离心5 min，置370C、50mL/L CO2孵箱中孵育6h后，轻轻混匀细胞，再以1500 r/min离心10 min。收集上清液在全自动生化分析仪（Olympus AU1000）340nm波长下测定光密度（A）。

杀伤活性（%）=（A实验组－A效应细胞自然释放组）/（A靶细胞最大释放组－A靶细胞自然释放组）×100%

1.2.5 统计学处理 采用SPSS 10.0软件进行数据处理，数据以均值标准差（χ¯ ±S）表示。组与组之间的比较采用独立样本t检验。

2.结果

2.1 γδT细胞培养和形态学观察及纯度鉴定 PBMC在γδT细胞培养基中培养24小时即可见贴壁生长，48小时后集落开始变大，培养10天可见大的集落和单个贴壁生长细胞。收集培养前后贴壁生长的细胞进行mAb荧光标记后经流式细胞术检测并分析结果见图1。培养前γδT细胞数为4.21%；培养10天时γδT细胞数为70.35%，CD44 达94.00%。

Before culture 10d culture

图1 PBMC 培养前后γδT细胞百分率和CD44 表达

Fig, 1 The percentage of γδT cell and expression of CD44 before and after cultured by PBMC

2.2 口服阿司匹林血药浓度的计算 为比较口服阿司匹林后血药浓度与体外试验药物浓度的关系，本试验进行了血药浓度的计算。阿司匹林口服后主要在小肠上部吸收，其生物利用度为68±3，蛋白结合率是49，口服3.5小时左右血浆浓度达峰值，阿司匹林的血浆半衰期（T1/T2）是15-20分钟。口服1克以下阿司匹林可按一级消除动力学：Ct=Co.e-ket 计算t时间的血药浓度（式中ke为消除速率数，Co为初始药量，Ct为t时间的血药浓度）。根据上述公式计算，口服阿司匹林400mg时最高血药浓度为75-136μg/ml。从表1中可以看出，血药浓度在144μg/ml以内对人γδT细胞抑制不明显。

2.3 不同浓度的阿司匹林对γδT细胞和消化系统肿瘤细胞株生长的影响 结果见表2，用阿司匹林诱导24h后，当药物浓度等于或小于0.4mmol/L时对γδT细胞和肿瘤细胞株生长均无明显的抑制作用；上升到1.6mmol/L时对γδT细胞的抑制率为21.7%，而对5种肿瘤细胞株均没有明显的抑制作用；阿司匹林浓度提高到3.2mmol/L时对部分肿瘤细胞才有一定的抑制作用，而此时的血药浓度已经达到576μg/ml，对γδT细胞的抑制率已达41.3%。从表中可以看出，虽然阿司匹林对5株肿瘤细胞的抑制率不相同，但是相同浓度对γδT细胞的生长抑制率显著高于肿瘤细胞株。

表1 阿司匹林对消化系统肿瘤细胞株的抑制率（%）

Tab,1 Effect of Aspirin on the inhibitory ratio of digestive system tumor cell lines

Drug concentration SGC-7901   SW-1990    SW-480      SW-1116      LOVO       γδT cell   About to the blood drug level of oral administration

Control（0mmol/L）  0           0            0        0             0          0               0

0.1 mmol/L        -5.3±0.6   -2.3±0.9   -2.7±0.7    -1.9±0.6   0.3±0.2    1.6±0.3      19μg/ml

0.2 mmol/L        -4.7±0.4    -2.8±0.7   -2.8±0.6    1.9±0.1    0.8±0.3    3.1±0.6      38μg/ml

0.4 mmol/L        4.8±0.8     -2.9±0.8   -3.0±0.9    1.2±0.3    -1.5±0.6    4.1±0.3     72μg/ml

0.8 mmol/L        -2.5±0.4    -1.3±0.3   -2.8±0.8    1.5±0.7    -5.1±0.9    6.7±0.8*△  144μg/ml

1.6 mmol/L        9.8±0.9△   8.8±1.8△   3.9±0.5    3.1±0.8    -3.6±1.2    21.7±2.2*△  288μg/ml

3.2 mmol/L        19.6±1.2△  11.8±2.0△  9.2±1.2△   6.4±0.9    1.6±1.3    41.3±3.8*△  576μg/ml

6.4 mmol/L        29.3±1.5△  23.5±6.3△  15.5±1.5△  8.8±2.2△   6.2±1.4   63.1±4.2*△  1125μg/ml

12.8 mmol/L       42.9±2.7△  47.6±5.6△  41.9±4.2△  23.7±4.7△  17.6±2.0△  79.5±5.1*△  2250μg/ml

25.6 mmol/L        70.2±5.3△  63.4±6.1△  61.5±5.1△  53.6±4.3△  42.3±3.3△  88.1±6.1*△  4500μg/ml

Aspirin by oral administration 400mg/d    75-136μg/ml

* P<0.05, Compared with the tumor cells which were treated with a sane drug concentration.

△ P<0.05, Compared with the same cell’s control group.

2.4 经阿司匹林处理后的效靶细胞杀伤活性检测 γδT细胞经不同浓度的阿司匹林诱导24h后对5种肿瘤细胞的杀伤活性在0.4 mmol/L～1.6 mmol/L时最强，浓度超过3.2 mmol/L时杀伤活性呈下降趋势；SGC-7901、SW-1990、SW-480、SW-1116和LOVO细胞经不同浓度的阿司匹林诱导24h后γδT细胞对其的杀伤活性除浓度在0.4～0.8 mmol/L时 LOVO和SW-1116明显升高外，其他组与对照组比较均无明显变化。结果见图2，3。

Fig, 2 Cyctotoxic activity of γδT cell on tumor cell lines which were induced by Aspirin

Fig, 3 Cyctotoxic activity of γδT cell which were induced by Aspirin on tumor cell lines

2.5 不同浓度阿司匹林诱导后的γδT细胞和5种肿瘤细胞株的凋亡率 结果显示，阿司匹林浓度等于或小于0.4mmol/L作用24h时均不能致γδT细胞和肿瘤细胞凋亡，在0.8mmol/L时对γδT细胞的凋亡率为9.31%，而对肿瘤细胞株没有明显作用。当阿司匹林浓度达3.2mmol/L时对部分肿瘤细胞才有一定的促凋亡作用，而此时γδT细胞的凋亡率已经达到52.71% 。从表2中可以看出，虽然阿司匹林促5株肿瘤细胞凋亡作用不相同，但是同一浓度致γδT细胞的凋亡率显著高于肿瘤细胞株。结果见表2和图4。

表2 不同浓度的阿司匹林对γδT细胞和5株消化系统肿瘤细胞株凋亡的影响

Tab, 2 Effect of various concentration Aspirin on the apoptosis of γδT cell and five kinds of digestive system rumor cell lines

                   SGC-7901      SW-1990      SW-480       SW-1116       LOVO        γδT cells

Control（0mmol/L）  0.39±0.6    0.39±0.8    0.39±0.8    0.39±0.3     0.39±1.1     0.62±0.7

0.2 mmol/L         0.89±0.9     1.93±0.9    1.35±0.7    1.01±0.5     0.79±0.4     1.41±0.8

0.8 mmol/L         3.57±1.1     4.56±1.1    4.56±0.5    4.56±0.6     2.56±0.7     9.31±1.2*△

3.2 mmol/L         7.88±1.2△   8.89±1.7△  6.21±1.2    4.47±1.2     3.67±1.0     52.71±3.6*△

12.8 mmol/L        32.97±1.3△  41.92±4.3△  21.66±3.6△  19.97±2.7△  18.67±1.5△  79.56±4.7*△

25.6 mmol/L        46.26±5.5△  55.44±5.2△  42.59±4.1△  31.61±3.8△  37.36±4.6△  88.17±5.2*△

* P<0.05, Compared with the tumor cells which were treated with a sane drug concentration.

△ P<0.05, Compared with the same cell’s control group.

γδT cell SGC-7901

SW-1990 SW-480

SW-1116 LOVO

图4 阿司匹林在3.2mmol/L时诱导的γδT细胞和5种消化系统肿瘤细胞株凋亡图

Fig, 4 The figure of apoptosis of γδT cell and five kinds of digestive system rumor cell lines which were induced by Aspirin (3.2mmol/L)

3.讨 论

西方流行病学调查发现，使用非甾体类抗炎药治疗类风湿关节炎患者的结肠癌发病率下降40-60% [2]。阿司匹林为非甾体抗炎药物的代表，长期用于治疗风湿、类风湿疾病，近十余年的研究表明：常规服用可降低消化系统恶性肿瘤的发生率和死亡率。随机试验已发现阿司匹林和环氧合酶2（COX-2）抑制剂可以降低40%有腺瘤或结肠直肠癌病史患者的复发[4]。一些研究认为，阿司匹林主要通过抑制COX-2的活性以降低前列腺素-2的合成发挥作用。COX-2是催化花生四烯酸转化为前列腺素合成过程中的一个关键限速酶。已知前列腺素除可参与维持机体正常的生理机能，如保护胃黏膜细胞，调节肾脏血流和控制血小板聚集等作用外，还可通过抑制抗肿瘤免疫反应而有利于肿瘤细胞的生长，或通过抑制巨噬细胞、T杀伤细胞、自然杀伤细胞活性以及肿瘤坏死因子、γ-干拢素、IL-1、IL-2等淋巴因子的产生等多种途径促进肿瘤的发生和发展[5]。

Hstdwick等[6]通过分析大肠癌细胞系的1176个癌相关基因DNA文库发现阿司匹林诱导的细胞，其凋亡基因和细胞循环相关基因诱导后多量表达或重新表达，提示阿司匹林具有诱导肿瘤调亡的作用。Pique等[7]发现，阿司匹林诱导不同细胞凋亡时，凋亡细胞线粒体中caspase-3,caspase-8和caspase-9的活性增加，提示阿司匹林诱导的细胞凋亡与caspase有关，但引发半胱天冬酶增加的机制尚未明确，有可能与细胞色素C的活性增加有关。钱跃清等[8]发现，口服阿司匹林400mg/d，4个月可使散发性结直肠腺癌直径缩小甚至消失。Jacobs等[9]研究发现，只有长期高剂量的使用才能减少肿瘤的发生。Eric等[10]最近报道，阿司匹林浓度达到360mg/d，并且长期服用（5-10年）才能明显减少结直肠癌的复发和发生。英国医生阿司匹林试验[11]（n=8857,其中，2/3服用阿司匹林300-500mg/d连续5年，1/3作为对空白对照，），并在试验后进行了>20年的随访发现可明显降低结直肠癌发生，而对胃和胰腺肿瘤作用不明显。这一结果与我们的实验结果相类似，我们的实验发现，用一定浓度阿司匹林诱导的γδT细胞仅能提高对SW-1116和LOVO细胞株的杀伤活性，而对SGC-7901和SW-1990作用不明显，是否提示，阿司匹林对结直肠肿瘤的预防作用可能与γδT细胞有关有。然而，许多实验结果显示[12]，阿司匹林体外诱导肿瘤细胞株凋亡或死亡试验所需的药物剂量是临床常规实际使用量的数倍，这些实验结果提供的数据明显脱离了实际临床应用事实。因此，我们选用不同浓度的阿司匹林在体外对γδT细胞和SGC-7901、SW-1990、SW-480、SW-1116和LOVO细胞进行诱导试验，以了解阿司匹林对人γδT细胞影响。

自20世纪80年代发现T细胞具有γδ受体以来，有关γδT细胞在免疫调节、肿瘤免疫监视和特异性初次免疫应答中所起的关键作用已不断地被认识[13,14]。Campillo等[15]证实，人外周血中培养的γδΤ细胞具有较强的抗肿瘤效应。γδT细胞在消化道等粘膜上皮中也有较高的比例，约占T淋巴细胞的10%-37%。吴志刚等[16]报告，癌细胞表达的Fasl与T细胞Fas结合可导致T细胞凋亡，而阿司匹林能降低结肠癌SW-480细胞Fasl蛋白表达，诱导淋巴细胞凋亡明显降低，并且随着阿司匹林作用浓度升高，诱导Jurkat细胞凋亡率降低。

从本实验结果可以看出，人外周血中培养的γδT细胞高表达CD44，CD44属于粘附分子家族的跨膜糖蛋白，它能与许多蛋白相结合，高表达CD44的γδT细胞能更容易与肿瘤细胞粘附，有效杀伤靶细胞，这与肿瘤细胞上γδTCR刺激物（如甲羟戊酸途径代谢物IPP）和NKG2D受体如MHC A、B，MHCⅠb和F1-AYP合酶以及粘附分子如ICAM-1等的表达水平密切相关[17]。因此，γδT细胞在抗肿瘤和免疫监视以及免疫耐受等方面有重要作用。

我们研究结果显示，阿司匹林在0.4 mmol/L～ 0.8 mmol/L对人γδT细胞杀伤肿瘤细胞活性有增强作用，高于这一浓度能明显抑制γδT细胞生长和引起细胞凋亡，并且减低其杀伤活性，而对肿瘤细胞株需达到3.2 mmol/L以上（血药浓度达576 μg/ml）时才有上述作用。这一结果与Paolo报道的：阿司匹林浓度加到3mM时还不能明显抑制大肠癌细胞的增殖和提高凋亡率相一致[12]。当阿司匹林浓度达到3.2 mmol/L时不仅会对存在于肠粘膜中的自身γδT细胞有显著的抑制作用，同时当血药浓度超过200μg/m -300μg/ml后，亦可出现机体的中枢神经损伤和肝肾功能损害。说明阿司匹林使用有浓度窗现象。浓度过高或过低人仅对机体的γδT细胞而且对机体的其他器官和功能均有影响。

本实验结果表明，阿司匹林在对消化道肿瘤的预防中γδT细胞可能是重要因素之一。阿司匹林在临床常规使用的药物浓度时可增强γδT细胞杀伤瘤细胞作用，超过这一浓度可明显抑制γδT细胞的增殖能力和杀伤活性，而该浓度对SGC-7901、SW-1990、SW-480、SW-1116和LOVO细胞抑制不明显。这一结果为临床阿司匹林预防消化道肿瘤的用量提供了实验依据。表明常规的非甾类药物使用量能预防消化道肿瘤的发生可能与粘膜层中的γδT细胞有关[18，19]。

阿司匹林诱导γδT细胞能提高其杀伤活性是否为阿司匹林促进细胞高表达ICAM-1有关有待进一步研究；经阿司匹林诱导后的SGC-7901、SW-1990、SW-480、SW-1116和LOVO细胞是否使其DNA损伤、DNA修复酶抑制、VEGF表达增加和casposes酶活性受抑制等 [20]是其更利于γδT细胞识别和杀伤有关有待进一步研究。

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