1、将切下的组织在手术台上请护士将标本放入低温生理盐水中(可不要动它),在手术完成时将标本放入PBS冰水液中并放入消毒的容器中带回实验室; 2、在超净台中将标本放入培养皿中,加入α-MEM洗涤; 3、获得组织切开,仔细辨认于关节反折处及增生的白色光滑的滑膜组织,附于关节软骨面的增生的血管翳也为滑膜组织(可作另一管消化),仔细剔除脂肪组织,用α-MEM洗二次(以去除红细胞),放在小青瓶中用解剖剪锐性切碎 4、用双倍获得组织的体积含有4mg/mlⅠ型胶原酶的α-MEM消化37℃孵育120分钟(在此期间震动混匀数次); 5、30分钟后收集第一管细胞:细胞悬液经70μm细胞滤网过滤,用1500-2000转离心6分钟,上清为Ⅰ型胶原酶加入未过滤网的组织,继续用于消化; 6、离心管底细胞用α-MEM离心洗涤2次,每次用α-MEM重悬浮后用1500-2000转,离心6分钟,最后一次用记数板观察到有细胞。细胞最终悬浮于含有10%胎牛血清的α-MEM中,接种到培养瓶中培养。 7、60钟后收集第二管细胞:细胞悬液经70μm细胞滤网过滤,用1500-2000转离心6分钟;用α-MEM洗2次,每次用α-MEM重悬浮后用1500-2000转离心6分钟,最后一次用记数板观察细胞并计数。细胞最终悬浮于α-MEM含有10%胎牛血清中,接种到培养瓶中培养。 8、必要时可做第三管细胞收集;并立即作原代滑膜细胞培养。 9、每2-3天换液一次。 体会: 1、虽然国内外文献有组织块培养法获得滑膜细胞,但我试过,没有获得滑膜细胞,可能方法没掌握好或实验条件不同; 2、我探索过用0.25% trypsin或0.25% trypsin+ 0.02%EDTA 或 collagenaseⅠ或collagenaseⅡ消化细胞或合用,只有单用collagenaseⅠ有用、最好; 3、机械法很难获得细胞; 4、全培用α-MEM或RPMI1640或DMEM,加10%胎牛血清。不能用小牛血清,胎牛血清用国产即可 5、必须用Ca-free的PBS。 |
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