材料 1、实验动物: 孕13d的昆明种二级小鼠。 2、主要试剂 主要试剂 来源 DMEM/F12 GIBCO rh-EGF peprotech rh-bFGF peprotech B-27 supplement GIBCO HEPES Sigma Trypsin Sigma Ploy-L-lysine Sigma 胎牛血清(FBS) 杭州四季青公司 青霉素 华美 链霉素 华美 胰酶阻断剂(STI) GIBCO 葡萄糖 药剂科制剂室 台盼蓝 西安化学试剂厂 蔗糖 西安化学试剂厂 酚红 西安化学试剂厂 KH2PO4 西安化学试剂厂 Na2HPO4.12H2O 西安化学试剂厂 NaCL 西安化学试剂厂 KCL 西安化学试剂厂 抗-nestin mab chemicon 抗-βtubulin mab chemicon 抗- GFAP pab neomarker 抗- GalC mab chemicon FITC 偶联荧光抗小鼠二抗 博士德 2、主要仪器 解剖剪 上海医疗仪器厂 虹膜剪 上海医疗仪器厂 眼科剪 上海医疗仪器厂 离心机 上海医疗仪器厂 自动双重纯水蒸馏器 教保处 微孔滤膜滤器 教保处 MCO-17AC CO2 培养箱 SANYO XTD-10A体视显微镜 芜湖光学仪器厂 无菌超净工作台 苏州净化设备厂 50ml 细胞培养瓶 NUNC 96孔细胞培养板 NUNC 24孔细胞培养板 NUNC 6 孔细胞培养板 NUNC 倒置显微镜 Leica OLYMPUS荧光显微镜 OLYMPUS OLYMPUS光学显微镜 OLYMPUS |
方法: 神经干细胞的培养 ①原代细胞的培养:取孕13.5天昆明种二级孕小鼠,引臼脱颈处死,碘酒、乙醇消毒腹部,逐层剖开腹部皮肤、肌肉、腹膜,取出子宫,放入盛有D1-SGH液的器皿中。仔细剥离胎膜、羊膜,暴露胎鼠,剪开颅骨,取出胎鼠脑组织并转移至另一盛有D1-SGH液的器皿中,体视显微镜下剥离脑膜,分离胎鼠纹状体,仔细剥离血管及脑膜,将收集到的纹状体在D-hanks液中漂洗两次,置于盛有4℃D-hanks液的器皿中,用虹膜剪将组织剪碎,加入0.125ㄇ的胰酶消化(37℃,15min),期间每隔5min震荡一次。500转离心5min, 弃上清,D-hanks液清洗两次,将沉淀细胞重悬于增殖培养基中,培养基成分:DMEM/F12(1:1),2% B27 supplement,青霉素、链霉素各100U/ml,EGF 20 ng/mL,b-FGF 10ng/mL。用火焰抛光的吸管反复吹打,分散组织制成单细胞悬液,吸取9滴细胞悬液、1滴0.4ㄇ台盼蓝溶液混合,用血细胞计数板在3分钟内计数出活细胞和死细胞(台盼蓝排斥法),调整细胞密度,以105个/ mL接种75mL培养瓶中(NUNC), 于5ㄇCO2 培养箱, 37℃培养。期间倒置显微镜下观察细胞的生长状况。 ②传代培养:当神经球直径大约100um时收集细胞于离心管中,600转离心5分钟,弃上清,加入无血清培养基重悬细胞,吸管轻轻吹打细胞,使之形成单细胞悬液,计数后以104个/ mL接种75mL培养瓶中,于5ㄇCO2 培养箱, 37℃培养,完成一次传代。此后每隔两天半量换液,5-7天机械分离细胞传代1次。期间倒置显微镜下观察细胞的生长状况。胚胎小鼠纹状体神经干细胞的分离培养及鉴定。
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