在甲醇酵母中表达蛋白的步骤比大肠杆菌复杂得多。首先要考虑选用什么载体。一般人们趋向于使用分泌表达载体，以便于蛋白的纯化。但有的蛋白并不适合于分泌表达，如一些胞质蛋白，非糖基化蛋白等。此外分泌表达的蛋白信号肽存在一个效率问题。有的蛋白即使存在信号肽，也不能分泌。并且有的分泌蛋白较易受到蛋白酶的降解。所有这些因素都需综合考虑。

1、酵母菌株的分离纯化

接种GS115于5ml YPD液体培养基，30℃，200rpm振荡过夜，涂布 YPD平板，30℃培养48 小时，用 YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板，4℃保存。

2、pPICZαA原核宿主菌TOP10F’的活化培养

TOP10F’做为菌种保存在－70℃条件下，在进行扩大培养抽提质粒之前，先要进行活化培养。

接种TOP10F’于5ml LLB（加入25ug / ml Zeocin）中，37℃，200 rpm ，培养16～18小时。

3、毕赤酵母表达的试验方法

3.1线状质粒DNA的脱磷酸化处理

重组载体只有被酶切线性化整合效率才能大大提高，环状质粒整合效率是很低的。选用不同的内切酶线性化可得到不同的转化子。如对载体pPC19选用BgiⅡ线性化，转化后可得到Muts表型转化子；选用SaI或StuI线性化，转化后可得到Mut+表型转化子。为了防止载体质粒DNA的自身环化，用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理酶切后的质粒DNA，具体操作如下：

（1）建立反应体系：

线性化的质粒                      35ul

10x CIP buffer                    4ul

CIP                               1ul

ddH2O                             5ul

——————————————————————————

total                             45ul

（2）在PCR仪上控制反应温度（加石蜡油封闭），37℃，15 min ；50℃，15 min；56℃，30 min（灭活）。

（3）在56℃未开始前停止，加入proteinse K ，用于灭活CIP，加入试剂如下：

反应物                 45ul

10x 5％ SDS            7ul

10x EDTA （pH 8.0）    7ul

proteinse K            5ul

ddH2O                  6ul         

———————————————————

total                 70ul

（4）纯化使用QIAquick spin kit ，按照2.2.3.3步骤进行，20 ul 灭菌ddH2O洗脱纯化产物。进行1％琼脂糖凝胶电泳，120 V， 观察纯化结果，并大约估计DNA浓度。

3.2 E.coli TOP10F’感受态细胞的制备及转化

（1）取10ul TOP10F’菌液，接种于200ml LB液体培养基中活化培养，37℃，200 rpm，16～18小时。取100ul菌液接种于200ml液体LB培养基中。

（2）37℃，200 rpm，培养16～18小时。

（3）灭菌500 ml离心管，4℃，4000 rpm，20 min。得菌体沉淀。弃上清，菌体用10％甘油重悬并洗涤。重复洗涤3次。

（4）第三次离心后，弃绝大部分上清，留下约1ml 液体用于重悬菌体。

（5）从制得得感受态细胞中，取200ul于灭菌EP管中，加入连接反应产物5ul，混匀，不要产生气泡，在冰上放置5min。

（6）将混匀后得200ul菌液移入电击杯中。

（7）使用电击穿孔仪进行转化，设置为电压 2500 V，时间 5 ms。

（8）电击后，往电击杯中加入 800ul SOC培养基，冲洗出菌体，转移至灭菌1.5 ml EP管中。37℃，150 rpm ，轻摇45～60 min。

（9）取全部均匀涂布于含 Zeocin 25 ug/ml 的LLB－Zeocin平板上，正放，待涂布液不在流动，37℃ 培养12～16小时。

注：设空载体做对照。

4、毕赤酵母电转化方法

对于P.Pastoris的转化目前有4种方法：①锂盐法；②PEG法；③原生质球法；④电穿孔法。锂盐法和PEG法方法简便，但效率很低，每微克DNA只有几十个转化子或更低，一般不多用。原生质球法和电穿孔法转化率都较高，而且一般可得到高拷贝重组，其转化率都可达到105/μg。但原生质球法操作繁琐费时；电穿孔法简便、快速、高效，是理想的转化方法。

线性化质粒DNA对Pichia pastorisGS115的转化

取新鲜制备的（或－70℃冻存的）感受态细胞置于冰浴中，使其完全解冻；

（1）将100μl菌体移出至一新的无菌Eppendorf管中，加入5－20μg线性化质粒（5～10μl），轻弹混匀，尽数吸出转移到0.2cm型的电穿孔转化杯中；

（2）转化杯置于冰浴中5～10分钟，保持低温。

（3）电穿孔转化电击条件：电压：1500V；电阻：400Ω；电容：25μF；脉冲时间：10mS；一次电击。

（4）电击后，马上在电击转化杯中加入1ml 4℃预冷的1M的山梨醇溶液，用微量移液枪吹打均匀，置于冰浴中；

（5）取30℃烘至表面半干的MD培养基平板，在超净工作台上无菌操作涂布平板，400μl/板；

将涂好的平板置于30℃正面放置至表面半干，然后倒置培养，4天后观察转化子情况

4.1 菌体的准备：

（1）挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD培养基的50ml三角瓶中，30℃、250~300r/min培养过夜；

（2）取100~500μl的培养物接种至含有500ml新鲜培养基的2L三角摇瓶中，28~30℃、250~300r/min培养过夜，至OD600达到1.3~1.5；

（3）将细胞培养物于4℃，1500g离心5min，用500ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；

（4）按步骤3离心，用250ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；

（5）按步骤3离心，用20ml的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；

（6）按步骤3离心，用1ml的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为1.5ml；

（7）备注：可将其分装为80μl一份的包装冷冻起来，但会影响其转化效率（2周之内）。

4.2 电击转化：

（8）将5~20μg的线性化DNA溶解在5~10μl TE溶液中，与80μl的上述步骤6所得的菌体混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中；

（9）将电转化杯冰浴5min；

（10）根据电转化仪提供的资料，参考其他文献及多次摸索，确定合适的电压、电流、电容等参数，按优化的参数，进行电击；

（11）电击完毕后，加入1ml冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5ml的EP管中；

（12）将菌体悬液涂布于MD或RDB平板上，每200~600μl涂布一块平板；

（13）将平板置于30℃培养，直至单个菌落出现。

推荐：电压1.5kV；电容25μF；电阻200Ω。电击时间为4～10msec。

5、Pichia酵母表达直接PCR鉴定重组子的方法

转化子可先在不含组氨酸的培养基上初筛。复筛可用PCR进行。即提取转化子DNA，用外 源基因两侧特异引物扩增筛选。然而，这只限于少量转化子转化子。太多则工作量太大。对于大量转化子的筛选，可用原位点杂交进行。即把相同量的不同转化子点在NC膜上，在原位对酵母细胞壁进行裂解，使之释放DNA。DNA经变性、中和后，可和由外源基因制备的探针杂交。用这种方法，在一张Nc膜上，可完成对几百个转化子的筛选。用原位点杂交不仅可以筛选大量转化子，而且可以鉴定多拷贝。这是因为当点到NC膜上的菌量相同时，转化子中外源基因拷贝数越多，则杂交后信号越强。

筛选出的转化子需鉴定表型，即确定是Mut+还是Muts。这两种不同表型在诱导表达的条件上有差异。可以把转化子同时点在MD和MM两块板上。在MD和MM板上生长差别不大的转化子为Mut+；相反，在MD上生长快，MM上生长很慢的转化子为Mutd。

5.1 模板的处理：

（1）平板上的菌落长到肉眼可见时（约12小时）；

（2）将除了模板之外的其它PCR反应液的组分准备好，并分装。引物最好使用Kit中已有的检测专用的引物，或者或者一条使用载体上的引物，一条使用基因的特异性引物（这样做可以鉴定非定向克隆的方向）；

（3）用半根灭菌的牙签（节约，而且好用）挑取菌落，在PCR管中涮以下，放入一个灭菌的1.5毫升离心管，对PCR管和1.5毫升离心管编号；

（4）PCR扩增，1％ agarose电泳；

（5）对于PCR扩增显现特异性条带的克隆，把置于1.5毫升离心管中的半截牙签扔到5毫升YPDZ培养基中，30度培养，8－12小时后提质粒，酶切鉴定确认。

注意：本试验方法应用在需要挑取的克隆较多（也就是克隆效率低），使用PCR初筛可以使工作量大为降低。

5.2 PCR反应体系：

以TaKaRa Taq DNA聚合酶反应为例：

组分                50μl体系   20μl体系

10xReaction Buffer   5.0μl      2.0μl

25mmol/L MgCl        23.0μl     1.2μl

2.5mmol/L dNTPs      5.0μl      3.0μl

Primer 1（10μmol/L）2.5μl      1.0μl

Primer 2（10μmol/L）2.5μl      1.0μl

ddH2O3               1.5μl      12.6μl

Taq DNA聚合酶        0.5μl      0.2μl

TOTAL5               0.0μl      20.0μl

5.3 PCR反应条件：

初始变性      94℃  4min

变性          94℃  30s   34个循环

退火         50~54℃ 30s

延伸          72℃  30s

结束延伸      72℃ 10min

保存          4℃

6、毕赤酵母基因组提取方法

（1）接种重组和空质粒转化子于5ml YPDZ培养基， GS115菌于YPD培养基作对照，30℃，培养16～18小时。

（2）室温下，1500 g离心5-10min收集菌体

（3）100 ulTE（pH 7.0）重悬，加入300 ul EDTA（pH 8.0），0.07M Tris－HCl，3 ulβ-巯基乙醇，1ul Lyticase ，37℃水浴30 min。

（4）10000g离心5~10min，取沉淀，加90ul TE重悬。

（5）200ul 饱和酚，200ul氯仿，混匀，离心30s ，取上层水相。

（6）加入两倍体积无水乙醇以及1/10体积的NaAC，-20℃放置30min；

（7）10000g离心20min，弃上清；75%乙醇漂洗沉淀一次；

（8）干燥后，加入15 μl的TE或H2O溶解，-20℃备用。

7、Mut+表型重组酵母的诱导表达实验

外源蛋白在甲醇酵母中的表达分两步，即菌体生长和蛋白诱导表达。先在以甘油为碳源的培养基上培养菌体，达到一定OD值后，离心弃上清，菌体悬浮于以甲醇为碳源的培养基中诱导表达。每隔24小时加一次甲醇，以弥补甲醇的损失。表达的条件有待优化，如通气状况，pH值，培养基的组成等等。一旦最佳条件确定，则可以按比例放大。从摇瓶培养转至大规模发酵。

（1）挑选一单菌落，置于装有25ml MGY、BMG或BMGY培养基的250ml摇瓶中，于28-30°C/250-300rpm培养至OD600=2-6(16-18 h)；

（2）室温下1500~3000g离心5min，收集菌体，用MM、BMM或BMMY重悬菌体，使OD600 =1.0左右（约100~200ml）；

（3）将步骤2所得的菌液置于1L的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30°C/250-300rpm的摇床上继续生长；

（4）每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0.5～1.0%；

（5）按时间点分别取菌液样品，取样量为1ml，置于1.5ml EP管中，最大转速离心2~3min，分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。时间点一般取：0、6、12、24、36、48、60、72、84和96h；

（6）对分泌表达，分离样品的上清液；对胞内表达，分离样品的菌体沉淀，带检测样品用液氮或干冰速冻后，于-80°C保存备用；

（7）可以用SDS-PAGE、Western-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。