摘要: 　目的　探讨脑微血管内皮细胞的体外培养方法并进行细胞超微结构研究及组织型纤溶酶原激活物(TPA ) 活性测定。　方法　取新生小鼠脑组织, 通过匀浆、过筛、胶原酶消化、差速粘附等技术对鼠脑微血管内皮细胞进行原代培养, 待细胞铺满瓶底时, 用01125%胰酶20102%EDTA 消化, 离心收集内皮细胞, 进行传代培养。原代、传代各取8 例, 吸取培养液用酶联免疫吸附试验测试TPA 活性。　结果　经Ð 因子相关抗原免疫组织化学鉴定、细胞超微结构观察, 证明培养的是血管内皮细胞。培养的脑微血管内皮细胞能合成分泌TPA。　结论　鼠脑微血管内皮细胞的培养为体外研究脑血管疾病提供了可靠的手段。

关键词: 　微血管内皮细胞; 细胞培养; 超微结构; 组织型纤溶酶原激活物; 小鼠

通常认为, 脑微血管内皮细胞主要参与构成血脑屏障保护脑。近年来研究表明, 内皮细胞不仅是屏障和半透膜, 还是重要的代谢和内分泌器官。它可以合成、释放血管紧张素(ACE)、白细胞介素( IL 21、IL 22、IL 23)、五羟色胺(52HT )、组织型纤溶酶原激活物(TPA ) 等多种因子。血管内皮是人体最大的内分泌腺, 几乎所有的器官组织都受其调节和影响[ 1 ]。因此, 体外内皮细胞的培养、超微结构的观察及生物活性的测定, 能为脑血管疾病的进一步研究积累资料。

1.材料与方法

参照已有的脑微血管内皮细胞培养方法[ 2～ 4 ] ,进行细胞培养。以直接取自生物体细胞、组织和器官开始的培养称为原代培养; 不论是否稀释, 当原代细胞铺满瓶底时, 将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养[ 5 ]。

1.1 原代培养　新生小鼠(福建医科大学实验动物中心普通级昆明种小鼠) 无菌条件下取脑, 置于4℃D2Hank’s 液中, 体视显微镜下剔除脑膜, 脑组织放入盛有适量D2Hank’s 液的玻璃匀浆器中上下匀浆10 次。经孔径88 Lm (220 目) 的尼龙网过滤匀浆悬液, 洗涤、离心(1200 r×10 m in) 收集滤网上面的微血管段, 用011% I 型胶原酶于37℃水浴中消化30m in, 吸管吹打。离心(1200 r×10 m in) , 弃上清后加D2Hank’s 液再离心, 重复一次。收集沉淀, 用含15% 新生牛血清的DM EM 培养液(Hepes 20mmo löL , EDGF 10 Llöm l, 青霉素100 U öm l, 链霉素100 U öm l) 悬浮接种于多聚赖氨酸覆盖的培养瓶中, 37℃、5%CO 2 的培养箱(美国Fo rm a 公司) 中孵育, 4 h 后换全液, 以后每2 天换液一次, 并用刮除法去除非内皮细胞, 至细胞铺满瓶底。培养过程中,细胞标本用SP 试剂盒进行Ð 因子相关抗原(福州迈新公司) 的鉴定。离心包埋法制备电镜标本, HU 212A 透射电镜下观察、摄影。

1.2 传代培养　待细胞出现“铺路石”征象, 弃培养液, 用01125% 胰酶20102%EDTA 消化, 并在倒置相差显微镜下观察, 当发现细胞回缩、细胞间隙增大后, 立即加血清终止消化, 离心收集内皮细胞, 以1∶2比例稀释接种于培养瓶中, 以后每两天换液一次至细胞铺满瓶底。

1.3 生化指标　原代、传代培养每组各取8 例, 待 细胞铺满瓶底时, 吸取培养液用酶联免疫吸附试验测试TPA 活性(TPA 试剂盒购自上海医科大学分子遗传研究室)。

2.结　果

倒置相差显微镜下观察经匀浆、过滤分离出的脑微血管段, 可见其呈单枝或分枝状, 内皮细胞核清晰(图1)。经酶处理后的微血管段, 接种1 h 后细胞开始贴壁, 最初细胞形态呈单一的球形, 培养5～ 7天后, 细胞呈长梭形, 至第12 天, 细胞铺展开来, 形成致密的单层细胞, 呈“铺路石”征象(图2)。生长成片后的培养内皮细胞没有向多层生长的倾向, 也没有边缘的重叠。透射电镜下观察(图3, 4) , 可见细胞胞质内质网、高尔基复合体发达, 游离核糖体、线粒体及吞饮小泡丰富, 胞质中存在大量走向一致的微丝, 尤以周围部明显。双层核膜清晰可见, 未见W eibel2Palade 小体。相邻内皮细胞间有紧密连接。原代细胞进行Ð 因子相关抗原免疫组织化学检查,可见细胞浆被染成土黄色(图5) , 证实培养的细胞为血管内皮细胞。原代培养内皮细胞TPA 活性为(191440±11728) ×10- 2 IU öm l, 传代培养内皮细胞TPA 活性为(161450±01562) ×10- 2 IU öm l。

3.讨　论

1865 年生理学家H is 首次提出内皮这一概念。其后的一百多年, 人们认为内皮是被覆于血管表面的机械屏障和光滑内膜, 近十几年的研究证明, 血管内皮不仅是机体重要的屏障和半透膜, 即微血管内皮细胞在血和脑之间形成选择性的渗透性屏障——血脑屏障, 而且还是机体重要的代谢和内分泌器官,它可以合成和释放几十种生物活性物质[ 1 ]。内皮细胞在血脑屏障中占举足轻重的地位。随着细胞培养技术的发展, 培养单层生长的内皮细胞为体外研究血脑屏障提供了较适宜的培养体系, 因为它们仍然保持活体内观察到的许多特性[ 6 ]。本研究通过匀浆分离脑微血管段、尼龙网滤过及胶原酶消化技术, 成功获取鼠脑微血管内皮细胞。

Ð 因子相关抗原的存在是血管内皮细胞最可靠的标志。通过免疫组织化学鉴定及形态学观察证明,所培养的为血管内皮细胞。W eibel2Palade 小体被认为是鉴定内皮细胞的依据之一, 但同一种属内血管离心脏越远, 内皮所含W eibel2Palade 小体越少。脑微血管离心远, 故电镜下未见W eibel2Palade 小体。电镜观察表明, 血管内皮细胞含有成束微丝, 这与汤健所描述的一致[ 1 ]。血管内皮细胞含有成束的肌动蛋白微丝, 它们既可以在内皮细胞的周围, 亦可在其中央部分出现。当内皮细胞长满培养皿, 并出现接触抑制时, 在细胞的周边部有大量成束的肌动蛋白微丝出现。在细胞的中央部分则随机分布一些较短的成束的微丝, 中央部微丝随着培养细胞数量的增加会逐渐减少。微丝的出现可能与内皮细胞受刺激后的收缩有关。

内皮细胞的另一形态特点是含有非常发达的内质网及高尔基复合体。这一点尤以胚胎和新生动物血管及再生血管内皮细胞更为明显[ 1 ] , 培养内皮细胞发达的内质网及高尔基复合体为其复杂的蛋白合成和分泌功能提供了可靠的形态学证据。内皮细胞的特征酶除了碱性磷酸酶、C2氨基转肽酶外, 本研究提示, 体外培养的脑微血管内皮细胞能合成分泌TPA。有报道认为, TPA 可作为培养的内皮细胞的功能活动性标志, 近年来有关TPA 的作用越来越引起人们的注意, TPA 是参与细胞外基质降解的蛋白水解系统的重要成分, 为丝氨酸蛋白酶。脑TPA由血管内皮、神经元和神经胶质细胞合成分泌[ 7～ 9 ] ,其中血管内皮起主要作用, 而脑微血管是脉管系统一个特化区域, TPA 由脑毛细血管内皮细胞分泌。由此推断微血管内皮即血脑屏障, 可能在脑微环境促进依赖纤溶酶的蛋白水解有一定作用[ 10 ]。

一定量的TPA 参与调节基质更新。TPA 降解细胞表面受体、细胞粘附分子或其他细胞表面和细胞外基质分子, 导致结构改变和突触重塑。故TPA的蛋白水解作用涉及神经细胞、神经胶质细胞的迁移及轴突的生长, 特别在胎儿及新生儿时期, 此作用更为显著。本实验中, 传代培养的内皮细胞TPA 活性降低, 可能由于传代培养的内皮细胞在体外环境发生改变, 合成分泌蛋白酶受到影响, 推测是缺乏胶质细胞的介导作用或者是由于传代后内皮细胞功能下降所致。要维持脑微血管内皮细胞的全部特征, 是否需要星形胶质细胞的参与, 有待进一步研究。本研究表明, 内皮细胞可以合成、分泌TPA。TPA 活性的测定有望成为检测内皮细胞功能的一种手段。

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