无菌操作技术

体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。因而,为在一切操作中最大可能地保证无菌，每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠。

Terms to remember

消毒(disinfection)和消毒剂(disinfectant)

灭菌(sterilization)

防腐(antisepsis)和防腐剂

抑菌(bacteriostasis)和抑菌剂(bacteriostatic)

无菌(asepsis)

无菌技术/无菌操作(antiseptic technique)

【培养前准备】

在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。这可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。

【操作野消毒】

无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次(拖布要专用)，紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。—些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。

【洗手和着装】

原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时，可穿着细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75％酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。

【火焰消毒】

在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。

培养瓶、滴管、试管、吸管、接种环、接种针

【操作】

进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。

培养细胞的观察

1、肉眼观察培养物颜色及混浊度

2、倒置显微镜观察细胞生长状态

细胞传代方法

根据细胞生长的恃点，传代方法有3种：

1、悬浮生长细胞传代

离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。  

2、半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）

此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。

3、贴壁生长细胞传代

采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。

贴壁生长细胞传代方法

1、吸光培养瓶中的培养液

2、加入1-2 ml 0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2-10 min（显微镜下动态监测）。

3、吸去胰蛋白酶液，加入培养液。

4、用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。

5、离心，细胞沉淀用培养液制成悬液。

6、吸取1/10—1/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。

7、加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。

8、将后者放入培养箱中培养。

细胞计数

培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。

血细胞计数器：手工计数细胞

Coulter计数仪：人工计数

细胞计数：

1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。

2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。

3、静置3分钟。

4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：

细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000

注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。

培养细胞活力测定

任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。

在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。

1、台盼蓝法

活细胞不被染色，死细胞染成蓝色；

用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力；

方法：

（1）将细胞悬液以0.5ml加入试管中；

（2）加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟；

（3）吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片；

（4）镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力；

死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。

活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。

2、四唑盐（MTT）比色法

四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝；

MTT比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值；

MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。

操作步骤：

（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37℃、5％CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）；

（2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）；继续培养3小时；

（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升／孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解；

（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570纳米）。记录结果，绘制细胞生长曲线。

细胞冻存和复苏

细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。

冻存和复苏的原则：慢冻快融

当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。

如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶很大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。

慢冻程序

标准程序：

当温度在-25℃以上时， 1～2℃/min

当温度达-25℃以下时， 5～10℃/min

当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中

简易程序：

将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2℃的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。

低温保护剂的应用

在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。

常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。

细胞冻存方法

1、预先配制冻存液：含20%血清培养基，10%DMSO，DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞；

2、取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（1×106 ～ 5 ×106细胞/ml)；

3、加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。

细胞复苏方法

（1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38℃水浴中，使其融化（1分钟左右）；

（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上；

（3）低速离心10分钟；

（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。

细胞培养的污染和检测

细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌和病毒。无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等是主要的污染源。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。

细菌和真菌的污染和检测

肉眼直接观察法

培养检查法

显微镜观察法

支原体的污染和检测

造成支原体高污染率的原因：

1、支原体大小0.1－0.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um）；

2、支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化 ；

3、过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式；

4、细胞流通间缺乏物品管理，造成实验室间的相互污染；

5、研究或操作人员忽略污染问题；

6、已受污染的细胞；

7、已受污染的培养基、血清。

支原体之检测

相差显微镜观察法

Hayflick培养基直接培养法

原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。 特点：是目前最直接与灵敏之步骤，亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。     缺点：培养时间长，须3－5星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出来 (例如M. hyorhinis)。需同时培养支原体株作为正反应对照组，可能会造成污染。

DNA荧光染色法

原理：利用荧光染剂（bisbenzimide, Hoechst 33258）检测支原体污染。此染剂会结合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich区域，因为支原体之DNA中A-T含量占多数（55～80%），所以可将其染色而检测。被支原体污染之细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之荧光小点，即为支原体之DNA，证明有支原体之污染。　

测试步骤用间接步骤，将待测细胞悬浮液或细胞培养液接种于指示细胞培养液中（indicator cell，例如Vero cell or 3T3 cell），然后培养指示细胞再作萤光染色。正负反应对照组亦可以接种于indicator cell内作为对照。

待测细胞亦可作直接测试，但需为吸附型细胞，培养后直接作荧光染色。有些细胞易有荧光背景，而干扰结果判读，则建议使用接种于指示细胞之步骤。

特点：简单、经济与灵敏，广泛使用，可作为例行之侦测步骤。可以侦测不易培养之支原体，例如M. hyorhinis，较直接培养法快，约一星期即可知道结果。

缺点：有时仍会有荧光背景，影响判读。

PCR方法

支原体菌株来源：M.Arginini ATCC23838 精氨酸支原体,　M.Fermentane　ATCC19989发酵支原体 ,　M.Salivarium　ATCC23064唾液支原体 ,M.Hominis　ATCC23114人型支原体 ,M.Orale　ATCC23714口腔支原体 ,M.Hyorhinis　ATCC29052猪鼻支原体。

其共同引物序列来自16s和23s保守区域：

外部引物为：

Ｆ1 5′-ＡＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＡＴ-3′，

Ｒ1 5′-ＧＴＴＣＡＴＣＧＡＣＴＴＴＣＡＧＡＣＣＣＡＡＧＧＣＡＴ-3′；

内部引物为：

Ｆ2 5′-ＧＴＴＣＴＴＴＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＴ-3′，

Ｒ2 5′-ＧＣＡＴＣＣＡＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＴ-3′。

无菌试验和测定菌数用培养基

品名                              英文名      用途

硫乙醇酸盐培养基 Thiogllycollate Medium    需氧菌、厌氧菌无菌试验

霉菌培养基           Mould Medium            霉菌无菌试验

改良马丁培养基          Modified Martin Medium    生物制品霉菌无菌试验

支原体半流体基础培养基 Mycoplasma Semifluid Base  生物制品支原体检查

支原体污染后的抗生素处理：

内酰胺类、万古霉素等: 不敏感

多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺: 耐药

四环素类、大环内酯类及一些氟喹诺酮:抑制

氨基糖苷类、氯霉素: 较小抑制作用

M-Plasmocin: InvivoGen公司研究开发,有效地杀灭支原体

常用抗生素用量和效应

                     抗菌谱

抗生素     细菌    真菌   支原体  常用浓度

青霉素      G+                     100u/ml

链霉素      G-                     100ug/ml

庆大霉素    G+ G-          +       200ug/ml

四环素      G+ G-          +        10ug/ml  

卡那霉素    G+ G-          +        50ug/ml 

两性霉素             +              2ug/ml

制霉菌素             +              25ug/m