软骨细胞的原代培养

龄新西兰乳兔(雌雄不限，共18只，分6次处理),溺死，置于75％酒精溶液中10分钟，拿入超净工作台，自眼外眦至耳屏前剪开皮肤暴露皮下组织，再次严格消毒，自外眦外将颧弓由根部剪断，暴露髁状突，去净髁状突表面软组织及软骨膜，以眼科剪剪取髁状突表面的透明软骨，以磷酸缓冲液（PBS含青霉素、链霉素各100U/L）冲洗2遍，将软骨剪切成1－3mm3 左右碎块，0.25%胰蛋白酶先消化30-35分钟，PBS浸洗2遍；后置于50ml玻璃培养瓶，加0.1％Ⅱ型胶原酶(DMEM配制)，37消化3.5－4.5小时，每小时置37℃恒温振荡箱振荡5min。直到软骨块大部分呈肉眼可见的絮状物，倒置显微镜下观察，软骨细胞大部分分离后，以弯头吸管轻轻吹打，细胞悬液以1200r/min离心7分钟，弃上清，以含10％新生牛血清DMEM的培养液终止消化，离心弃上清以洗去细胞表面的酶，悬浮细胞并计数，台盼蓝染色检测细胞活力为90％。将细胞以2×105/ml接种于25cm2培养瓶内，置于37 ℃恒温, 5％CO2 浓度,饱和湿度培养箱内培养。2天后换液1次，以后隔天更换培养液，倒置显微镜观察、照相记录细胞形态及贴壁生长情况。待细胞贴壁达到85％－90％后传代。

软骨细胞的传代培养

待细胞贴满壁后传代。传代时,吸干培养液,用PBS液轻洗细胞2次，培养皿内加入0.25％胰蛋白酶－0.01％EDTA（1比1）消化液,以覆满瓶底为限,置温箱2～3 min 后,显微镜下观察到细胞质已回缩,细胞间隙增大，即向培养皿里滴入2 mL 左右含血清的培养液终止消化,收集第1代培养细胞，用弯头吸管吸取混和液,反复多次轻吹皿底细胞,使细胞彻底从培养瓶底壁脱落,收集细胞混和液, 1200r/min离心7分钟, 弃上清，以含10％新生牛血清的DMEM清洗细胞3次,制成细胞悬液，将细胞以2×105/ml接种于25cm2培养瓶内，置于37 ℃恒温, 5％CO2 浓度,饱和湿度培养箱内培养。隔天更换DMEM培养液。以第3代软骨细胞制成细胞悬液并计数，台盼蓝染色检测细胞活力为90％，调整细胞浓度为5×107/ml,用于实验。

传代　

吸干培养液,用PBS 液轻洗细胞2次,培养皿内加入0.25 %的胰蛋白酶,以覆满皿底为限,置温箱2～3 min 后,显微镜下观察到细胞质已回缩,细胞间隙增大,少部分细胞已浮于消化液中,用吸管吸取混和液,反复多次轻吹皿底细胞,使细胞彻底从培养皿底壁脱落,收集细胞混和液,离心,用PBS 液漂洗2 次,再制成细胞悬液,计数,检查细胞活力,按每个培养皿接种2 ×105 个细胞再培养。