背景知识 : 细胞培养的传代及日常维持过程中,在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费,而且细胞一旦离开活体开始原代培养,它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久;细胞储存在液氮中,温度达-196℃,理论上储存时间是无限的。 原理 : 细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融,实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂,这两种物质能提高细胞膜对水的通透性,加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外,减少细胞内冰晶的形成,从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法,这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化,避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。 一、材料 (一)仪器 1. 净化工作台 (二)玻璃器皿 1. 吸管(弯头、直头) (三)塑料器皿 1. 吸头 (四)其他物品 1. 微量加样枪 (五)试剂 1. D-Hanks液 二、操作步骤 (一)细胞冻存 1. 配制含10%DMSO或甘油、10~20%小牛血清的冻存培养液; (二) 细胞复苏 1. 从液氮容器中取出冻存管,直接浸入37℃温水中,并不时摇动令其尽快融化。 三、注意事项 1.从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存,但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液; |
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