在人体发育过程中，γδΤ细胞先于αβΤ细胞出现，γδΤ细胞 主要分布于皮肤，小肠、食道、肺和生殖器官等上皮组织内，而在外周血中淋巴细胞仅占0.5%-5%。外周血中γδΤ细胞主要为Vγ9Vδ2、δ1Τ细胞，它在抗感染、抗肿瘤和免疫监视以及免疫耐受等方面具有重要的作用，但在其反应机制方面仍然了解不多。在体外大量扩增Vγ9Vδ2、δ1Τ细胞是研究γδΤ细胞生物学功能和用于临床肿瘤治疗的重要步骤。国内已报告多种γδΤ细胞体外培养方法[1-5]，现介绍一种新的γδΤ细胞体外快速扩增方法。 

1、材料和方法

1.1 材料和仪器

RPMI-1640（Gibco公司产品），人AB血清来自徐州市血站，胎牛血清和淋巴细胞分离液购自中国科学院血液病研究所，异戊烯焦磷酸(isopentenylpgrophosphate.IPP)购自sigma公司，IL-2（夏门），抗人TCR-γδ-FITC，抗人CD3Ab-PE，抗人CD44Ab-FITC，均购自杭州联科生物（Immutech,French）,K562细胞和SGC-7901胃腺癌细胞由中国科学院上海细胞所提供，流式细胞分析仪（FACSC alibur.Becton Dickinson），分析软件为CellQuest，每个标本分析细胞数≥1×104  。 

1.2  方法      

(1 ) γδT细胞的培养 取健康献血者静脉抗凝血100ml，经1500r/min离心15min,再吸取白细胞层约10ml加入淋巴细胞分离液上，以2000r/min离心20min，吸取单个核细胞（PBMC）层，用生理盐水洗涤，1500r/min离心10min，洗涤3次后计数细胞后备用。将PBMC加入γδT细胞RPMI1640培养液中（含10%小牛血清和5%人AB血清），调整细胞数为1×108/L，置250ml细胞培养瓶中，于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，根据细胞生长情况及时添加培养液。

(2 ) TCRγδT细胞鉴定 用抗TCRγδ-FITC、抗CD44FITC和抗CD3PE与培养10天时收集的培养细胞直接染色后进行流式细胞仪检测分析，阴性对照为FITC标记的正常人IgG。

(3)  γδT细胞形态学观察 用数码相机拍摄培养2、10天时细胞生长状态和培养10天时的细胞的瑞氏染色后的形态并进行透射式电镜检查。

(4)  γδT细胞杀伤活性检测 用本室建立的乳酸脱氢酶释放法测定γδT细胞杀伤活性[6]，以K562细胞和SGC-7901胃腺癌细胞作为靶细胞，按效靶细胞比5:1、10:1、20:1、40:1的比例加入γδT细胞，37℃、50%CO2条件下孵育6小时，收集上清液在全自动生化分析仪（Olympus AU1000）340nm波长下测定光密度（A）。

A实验组－A效应细胞自然释放组
杀伤活性（%）ㄔ_____________________________________ ×100%  

A靶细胞最大释放组－A靶细胞自然释放组

(5)  IPP和IL-2用量确定 参照文献报告我们分别选择IPP浓度分别为0、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6、51.2 ng/ml，IL-2浓度为100 IU、200 IU、400 IU 和800IU/ml进行正交设计方法培养，最后确定IPP和IL-2使用浓度。

2 、结果

(1) γδT细胞培养形态学观察 PBMC在γδT细胞培养基中培养24小时即可见贴壁生长，每个集落约3-6个细胞，48小时后集落开始变大（图1），培养10天可见大的集落和极少量单个贴壁生长细胞，单个细胞可见细胞呈条梭状，整个集落形态与用TNF培养后的树突状细胞较为相似（图2），也有部分呈浮悬生长的细胞。培养10天的γδT细胞涂片行瑞姬氏染色发现大多数细胞体积大，呈椭圆或不规则形，细胞核大多为椭园或园形，核染质疏松，核膜不规则，有凸起，每个细胞可见1个小核仁，呈深蓝色；胞浆丰富，染成灰兰色，形态不规则，有的像伪足，近核处有淡染现象，也有呈不规则形（图3）。

图1 培养第2天细胞生长形态 图2 培养第10天细胞生长形态

图3 培养10天后细胞瑞氏染色结果

(2) γδT细胞纯度鉴定 收集培养10天时的细胞行荧光标记单抗染色后经流式细胞仪分析结果。PBMC未培养前γδT细胞数为4.69%，培养10天时的γδT细胞数为70.35%。悬浮生长细胞CD44为86.39%，贴壁生长细胞CD44为94%，从2张图片对照可以看出贴壁细胞有一部分高表达CD44。

PBMCs培养前 培养第10天

培养10天悬浮细胞CD44的表达 培养第10天后贴壁细胞CD44的表达

图4 不同培养时间的γδT细胞流式细胞图

(3) IPP和IL-2用量确定 根据文献报告我们分别选择IPP浓度分别为0-50 ng/ml，IL-2浓度为100-800 IU /ml进行正交设计方法进行培养，最后确定IPP浓度为2ng/ml，IL-2为100 IU/ml（图5）。在培养10天时，γδT细胞扩增倍数可达100倍。

(4) γδT细胞对异种肿瘤细胞的细胞毒作用 用K562细胞和SGC-7901胃腺癌细胞作为靶细胞，效靶细胞在40:1、2:10、10:1、5:1时，γδT细胞杀伤活性结果见图6。

3、讨论

自上个世纪80年代前发现T细胞具有γδ受体以来，有关γδΤ细胞在免疫调节，肿瘤免疫监视和特异性初次免疫应答所起的关键作用已不断地被认识[7]。如何能在体外培养出大量的高纯度的γδΤ细胞是目前研究和临床应用γδΤ细胞必需解决的一个重要问题。国内以往在体外培养扩增γδΤ细胞通常用γδTCR单克隆抗体固相包被、结核杆菌低分子多肽抗原诱导、HSP70多肽诱导和磷酸脂配体诱导等方法。我们应用IPP和IL-2共刺激法在体外培养10天时γδT细胞的比率从培养前4.21%升至70.35%，γδ细胞增殖倍数达100倍，对NK细胞敏感的K562细胞杀伤活性在效靶比为40：1时达75%，对SGC-7901胃腺癌细胞在效靶比为40：1时的杀伤率为61%，表明γδT细胞有较强的抗肿瘤活性。

γδΤ细胞能直接识别的抗原有应激抗原、磷酸化抗原和热休克蛋的同源分子等，因此，在体外用这些物质激活诱导后和在IL-2存在时可引发γδΤ细胞增殖。Thompson等[8]认为，小的非肽类“抗原”激活末梢血中的Vγ9Vδ2 T细胞主要有三类化合物：焦磷酸单酯（如IPP）、含氮双磷酸酯（N-BPs）和烷基胺。前者是Vγ9 Vδ2T细胞的真正的激动剂，而后者则是通过抑制使二磷酸合成酶（甲羟戊酸途中的一个关键酶）导致细胞内IPP蓄积而间接激活 Vγ9 Vδ2T细胞。关于非肽类“抗原”激活γδΤ细胞导致细胞增殖机制仍不十分清楚，可能是结合非肽“抗原”的TCR中的γε二聚体与ζ和CD3γδε多肽键共价结合后活化触发信号通过跨膜信号传导事件诱导相关基因（包括IL-2受体）表达，在外源性IL-2存在时发生细胞增殖。我们结果发现IL-2的最适培养浓度为100U/ml，而在200-800U/ml时并不能增加其增殖倍数，其机制有待进一步探讨。Otto等分析用IPP诱导扩增正常供者的PBMCs中的γδΤ细胞表型发现，大部分为Vγ9Vδ2亚型（21-100%），小部分为Vγ9Vδ1亚型，用IPP刺激后高分泌IL-10、TNF-α、GM-CSF和IFN-γ[11]。

CD44是一种跨膜糖蛋白质分子，是T细胞的激活标记，它具有参于信号传递，促进细胞间粘附和细胞迁移等生物学作用。我们结果发现扩增后的粘附性γδT细胞CD44为94%，悬浮生长的γδT细胞为86.39%。Chao等人[9]报告在淋巴结、peyer氏结和表皮内γδΤ细胞CD44的表达具有异质性，我们发现末梢血中γ9δ2Τ细胞也有部分高表达CD44，有关这一亚群的生物学特征有待进一步研究。γ9δ2Τ细胞杀伤肿瘤细胞的细胞毒作用主要是通过穿孔素/颗粒酶途径和Fas/Fasl途径。Corvaisie等[10]对结肠癌杀伤作用研究表明，其杀伤作用与肿瘤细胞表面表达Vγ9Vδ2TCR刺激物如甲羟戊酸途径代谢物（IPP）和结合NKG2D的配体（如ICAM-1）有关。我们结果表明γδT细胞对K562细胞和SGC-7901胃腺癌细胞有较强的杀伤活性，可能这二种细胞株也高表达IPP和ICAM-1有关。

体外实验证明，γδΤ细胞能杀伤结肠癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌等实体瘤细胞，对正常细胞无杀伤作用，但对某些肿瘤如乳腺癌、神经母细胞瘤等无杀伤作用。朱忆斯等人曾用自身末梢血中γδΤ细胞治疗四例青年胃印戒细胞癌，随访6-15个月未见复发，表明治疗是安全的[2]。我们在5例知情同意的胃癌患者进行治疗证明 ，输注自身γδT细胞是安全的。

Agrati等用IPP诱导扩增PBMCs中Vγ9Vδ2T细胞与含有HCV复制的Rep60细胞共培养发现，Vγ9Vδ2T细胞通过释放IFN-γ抑制次基因组HCV复制[13]，因此，随着对γδΤ细胞研究的不断深入，γδΤ细胞抗肿瘤作用、抑制病毒复制和免疫调控作用以及在特定条件下具有的抗原提呈功能等激发人们对γδΤ细胞研究的极大兴趣。我们建立在体外扩增γδT细胞的方法，将会对γδT细胞的上述功能的进一步研究和为γδT细胞用于肿瘤患者的临床前试治提供一种简单有效的方法。