组织中的细胞周期和凋亡检测方法之一－－PI法

schoman

无论是肿瘤或其它正常新鲜组织均可用PI（碘化丙啶）的方法来检测，这是一种常见而且便宜的方法。主要操作步骤如下：

1、组织块用0.25%胰酶消化30min－1h。

2、200－400目筛网过滤细胞，获得单细胞悬液。

3、75％乙醇（－20度预冷）固定细胞1h。

4、加入PI（终浓度50ug／ml）和无DNA酶污染的RNA酶（终浓度50ug／ml）1ml染色30min－1h。

5、流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。

注意事项：

1、组织消化后使细胞形成单个细胞悬液是本检测方法的关键。如组织难以消化，可加入适量胶原酶。另外，消化前，用剪刀将组织剪成小块也不要忘了。

2、细胞可尽量的多准备（at least 100 thousand），这样流式检测方便，结果可靠。

3、每次消化的时间等条件应尽量一致，否则使实验结果CV值偏大。

4、细胞用乙醇固定后可以访置48小时（4度保存）后检测，便于无法立即检测的实验者，对实验结果基本没有影响。

其它也有一些检测凋亡的方法，均有商品化试剂盒。在此不赘述。

yanzishenyang：我看相关的说明：碘化丙啶（propidium iodide,PI）检测 早期死亡细胞膜通透性状态的不同是区分细胞凋亡和坏死的一个重要指标，凋亡细胞在进入最终溶解阶段前，胞膜通透性无明显改变，相对分子质量大的与DNA结合的荧光染料（如PI）不能时入凋亡细胞内，而相对分子质量小的荧光染料（如Hoechest 3342或33258等）仍能被细胞摄取。应用流式细胞仪或荧光显微镜可区分和坏死细胞，细胞内DNA出现Hoechest 3342标记而不出现PI标记的为凋亡细胞。

偶得细胞是用PI染色的，经过流氏细胞仪检测出现一个亚二倍体峰，是否能和坏死区别？因为偶用的作用细胞的蛋白本身可以造成细胞膜的损伤，所以PI可以进入细胞，这是否意味着我检测的结果无法区分凋亡和坏死？

hdhdhd0000：用PI法识别凋亡时，有一种方法叫SUB-G1法，这种方法需要在染PI前加入适量的破膜剂（磷酸盐－枸橼酸盐缓冲盐），我们称之为PC液，它会让晚期凋亡所形成的DNA小碎片部分出膜而使胞内的DNA总含量减少，从而使流式上的DNA直方图的G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰，也就是SUB－G1峰（凋亡峰）！

用荧光2的面积做直方图可以清楚的看见凋亡峰，但是要区分APo和Nec需要少量的经验，而在荧光2高度图上，因为是用的是对数，所以可以把凋亡和坏死拉开，凋亡峰在不同的细胞周期特异性细胞凋亡时，都特异性的出现在10的2次方荧光道数处，坏死在10的1次方处，从而可以清楚的分清它们。

核染色剂（核染料）

yuanaiyu：用流式细胞仪测脑组织细胞悬液中细胞线粒体的膜电位，需先将细胞与细胞碎片区分开来，现考虑用一种亲细胞核的染料将细胞分选出来，已尝试用过PI，但pI分子量大，过分破坏细胞膜而影响了线粒体膜电位。请问有没有一种小分子的核染料，既能进入细胞核又对对细胞膜的影响很小？何处能买到？

shaman3: 常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI4（6-diamidino 2-phenyl-indole dihydrochloride）。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。

Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。

DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。

至于什么地方能买到，DAPI常用在免疫荧光中，各大试剂公司都可订到，本人比较偏于DAPI，就是因为用过后发现它将细胞核染得很漂亮，如图（自己做的）：

flyingrisker: 流式本身就有区别细胞和细胞碎片的功能的呀。只要你在选要分析的细胞群落的时候，只选相对比较密集的细胞区域，就可以把碎片的感染去掉了。

你如果一定要用核染料，我觉得Hoechst33258不能用，因为它是紫外激发的，可能会对你的细胞线粒体膜电位有影响。

至于核染色的漂亮与否，大家可以比较一下。这是我用Hoechst33258染的细胞核，如图

PI的配置

deardeer：PI怎样配制？怎样保存？有的文献说要用柠檬酸钠溶解，这对实验有影响吗？如果不这样，那直接加入而不用柠檬酸钠溶解可以吗？

hinavy：PI配制I 15mg ,枸缘酸钠0.1g, NP-40 0.3ml,加蒸馏水至100ml,4度避光保存

sunandsuny：也有的直接用PBS配的,也有的用1.0%Triton-X100*0.9%NaCL配的,浓度都是1mg/ml.

andywang：我用来做流式的PI配制方法是: 5mg PI +0.1ml Triton X-100 +3.7mg EDTA +10ml PBS,4度避光保存。为储存液，用时稀释10倍。

PI染液配方，用于DNA倍体检测

hawaii_flyer：请大侠给个PI染液配方，用于DNA倍体检测

cells：一般好象有两个浓度。可购自PHARMAGIN或SIGMA。

1、 比如用流式细胞仪测定神经细胞凋亡取缺氧-复氧培养各组海马神经元, 用2.5 g/L胰蛋白酶消化(37℃、30 min)分散, 置于4℃冷乙醇中固定后, 在1×109个细胞/L密度的细胞悬液中加入1 ml碘化丙啶(PI)染液(100mg/L), 4℃染色30 min, 用FACS流式细胞仪测定荧光强度， 激发波长488 nm，每次测定106 个细胞。采用Modfit 分析软件进行细胞DNA含量分析， 低于G1 期二倍体DNA含量的细胞为凋亡细胞。

2、 FACS检测凋亡细胞的亚二倍体DNA. 新鲜小鼠胸腺细胞细胞加入75％乙醇过夜, 次日用PBS洗2次, 加入PI(碘化丙啶)低渗染液(50 μg/mL PI, 0.1%柠檬酸钠, 0.1% Triton X-100), 以FACS检测细胞核DNA中亚二倍体的凋亡DNA波峰.

1）冰乙醇固定后无需穿孔？

2）低渗PI染液中Triton用量是多少？有的是100染液中用1％Triton 0.5ml。对吗？

3）配方：

柠檬酸三钠 　 　　0.25g

Triton-X 100 0.75ml

Propidium iodide 0.025g

核糖核酸酶　　　　 　0.005g

蒸馏水　　　　　　　　250ml

PI染色的剂量问题

midas：我要用PI染色培养的细胞，科里的PI浓度是50ug/ml，但是这是染组织切片用的，但是我要用它来染细胞，不知此时PI的应用浓度是多少，

jmtang：流式细胞仪PI染色死细胞方法 。PI能够插入双链DNA中。它被活细胞排斥但能穿透正在死亡或已经死亡的细胞的细胞膜。

Ⅰ、材料

1、PI（e.g.,Cat #537059,Calbiochem,San Diego,CA）

2、缓冲体系：1×PBS(Ca2+ and Mg2+ free,e.g.,Cat#9240,Irvine Scientific,Santa Ana,CA)+2%新鲜小牛血清＋0.1%叠氮钠

A、PI缓冲液 ：用缓冲液将PI溶解至终浓度为1mg/ml中，于4℃下密封避光保存1个月。

B、PI浓缩液 ：用缓冲液将PI溶解至终浓度为500mg/ml，于4℃下密封避光保存。我们已经检测过将PI浓缩液放置数月后，并无观察到染色活性的丢失。

Ⅱ、方法： 将样品细胞按程序描述的方法用FITC标记的单克隆抗体进行单色染色。

A、在最后的洗涤步骤后，将样品细胞悬浮于PI缓冲液中，于4℃下密封避光保存以备通过流式细胞仪分析；

B、在最后的洗涤步骤后，如前述将样品细胞悬浮后备用。如果您想检测样品细胞活力，在每一管中加入2μl的PI浓缩液，混匀。将样品置于4℃下密封避光保存以备流式细胞仪分析。

注意：此法并不适用于甲醛固定的样品。在根据Sasaki等人的方法（Cytometry 8:413,1987）用PE标记的抗体对样品进行染色时可以适用此方法。然而，由于PI和PE的发射光谱的广泛交迭，因此本方法适于用7-氨基-放线菌素D将死细胞加以区分。

midas：昨天用PI染色出现灾难性后果，加入PI后，细胞全部脱壁、死亡，荧光下看一片红色，可惜我养了好久的细胞一下子就完蛋了！ 分析原因，我用的PI本来是用于然组织片的，为了增加膜的通透性，里面加了triton-X 100，这可能就是给我细胞带来灾难后果的原因，所以再次提醒自己：做细胞染色以及电镜时，一定不能加triton。 一切都要重来！ 再次请教：

1、配PI的PBS的浓度是多少？

2、做细胞染色PI的应用浓度（培养液中的终浓度）是多少？

Huolj8：我染细胞PI用10ug/ml ，这是终浓度。

midas：用于配制PI的PBS浓度是0.01mM吗？

Huolj8：PBS是一种缓冲液，其成分包括NACL，KCL，等。好象不能用多少mM算吧。

PBS:1000ml

KCL:0.2g

NaCl:8g

Na2HPO4:1.15g or:Na2HPO4.12H2O:2.9g

KH2PO4:0.2

schover：用PI染色来区分死细胞和活细胞,浓度可以从5ug~20ug，我都试过，都可以，至于PBS没有什么特殊要求，只要是能够满足细胞培养即可。用Hank's液、生理盐水也可以代替。

碘化丙啶（PI）有没有毒

guagua：我要做细胞荧光染色了，要用碘化丙啶（PI），与PI分子结构类似的EB（溴化乙啶）是强致癌剂，PI致癌性如何啊？

gy：有毒的，荧光染料，染DNA的试剂都有毒的

Fang CY：对每一个爱惜生命的人，发出如此只问是可以理解的。但也相信提这样问题的人都是些刚进实验室的新手。他们对一切充满了好奇，对一切所谓有毒，有害的事情又充满了恐惧。他们总是希望收获好东西，而让坏东西离自己远远的。但这样的事情很难两全其美。要收获，就要付出，当然并不是要一定付出生命代价。在实验室里，有太多的东西都是所谓的有害，有毒的，要想完全避开它们是不可能的，因此，有两点要做到：1. 适当注意防护，如戴手套，口罩等，有很多人平时实验时不传隔离衣，(包括老外，例如我们研究所，平时根本看不到有人穿)，但在某些特定实验下，还是要穿的。2.克服心里障碍，这是最重要的一点。如果在实验时，心里总是想者接触的试剂如何有毒，不但实验做不好，很可能会产生某些对身体的伤害，而这些伤害不是由於试剂本身的毒性导致而是由於心里因素导致。我现在有一同事，由於对同位素恐惧，一到同位素实验室便大汗淋漓，腿脚发软！而一接触到病毒，就要再三的用酒精擦手，洗多次手。虽然这样做可以理解，但我认为还是心里不健康的反映。我在北京疾病控制中心研究HIV时，刚开始也是非常紧张，但两周后，一切都变了。原先听一个在此工作过的同学讲，接触活HIV的人在进入P3实验实时，穿戴的象太空人。可实际情况并非如此，只不过戴普通手套，套袖和隔离衣罢了。而一旦克服了心里障碍，就不再为此而担惊受怕。

robert1：当然是有毒的，每次使用的时候都要有防护措施，如戴上一次性手套。但毒性不会太强，用不着担心，只要不是直接接触到皮肤或进入消化道就没什么可怕的啦

ＰＩ染色上流式检验细胞增殖

春潮带雨：我用我的药物作用ＰＢＭＣ，希望有抑制其增殖的作用．想用ＰＩ染色在ＦＡＣＳ上检测，请告之具体详细的操作方法，

little_G：ＰＩ染色上流式检验细胞增殖比较容易，主要两个指标：1，增殖指数；2，S期细胞分数。

一般用PI染色需要先把细胞固定或者打孔。比较简单的用75％酒精固定就可以了。一般固定1个小时以上，或者冷藏过夜。

具体方法：收集细胞，离心(转数根据细胞种类和离心机的参数自己摸索)。用PBS洗涤2次，冷乙醇固定，隔夜。离心除去乙醇，用PBS洗涤2次，加RNA酶0.5 mL，碘化丙啶（0.5ml）冷暗处染色30 min。上机检测。用CELL QUEST软件分析结果（苹果机自带的软件）。

注：

1、加RNA酶用来分解RNA，防止其干扰，很重要。

2、具体加染色剂的体积也是要根据细胞量以及配置的浓度来确定，需要自己摸索。

春潮带雨：那相关的ＰＩ染色Ｋit呢，请介绍好吗

little_G：RNA酶和PI自己配就行，试剂盒很贵哦！也可以几个同学合买一小瓶PI和RNA酶。

PI染色后涂片可保存多久

zdwyzhy: 本人想用形态学检测凋亡，方法是用PI和Hoechst双染后涂片在莹光显微镜下计数，想请教前辈高人，涂片后可保存 多久？

Clifford: 看你是怎么做的了! 我们家领导做的片子可以保存半年!(4度) 最需要注意的是封片子, 封得好保存的时间就长!

其他

zzzyyy1977: 我想测细胞周期，用PI染液。是否一定要用RNA酶呢？

qingshi: 是的,毋庸置疑,必须用.因为细胞周期是测DNA复制,需用RNA酶降解RNA,防止干扰.

在细胞周期内,DNA含量随细胞内时相发生周期性变化,正常情况下,大多数细胞处于休止期(Go), G1期细胞虽有DNA合成，但DNA含量仍为2N，为二倍体细胞,;处于活跃的DNA合成期(S期)的细胞DNA含量为2N-4N;正经历细胞分裂(G2/M期)的细胞含有最大量的DNA(4N)。细胞经固定后用PI(Propidium Iodine 碘化丙啶)等荧光染料染色即可上机测定。但标本需先经RNA酶处理以排除RNA干扰。FCM可在测量大量细胞(数分钟可测定105个细胞)后给出DNA分布直方图,正常人外周血DNA示意图，图中第一个峰(G1)是DNA含量为2N 的细胞峰, 第二个峰是DNA含量为4N 的细胞峰,两峰之间是DNA含量为2N-4N的处于活跃的DNA合成期(S期)的细胞。用厂家提供的Multicycle软件，计算机可自动计算出G1%、S+G2M%;如用DNA/RNA双参数分析,可得到G0:G1%,G0/G1期DNA指数, 如标本中有凋亡细胞,在G1峰前会出现一个亚G1期峰,软件可自动计算出凋亡细胞的%。

正常人外周血DNA示意图(采自Coulter Training Guide)

DNA倍体分析的临床有价值的指标是DNA非整倍体和/或超二倍体%和四倍体%增高。这些改变是肿瘤细胞的特异性改变,和实体瘤相比,急性白血病非整倍体发生率较低,约30～40%。

zzzyyy1977:是看到有的文献上只写上PBS 洗，冷乙醇固定，再洗，加PI染液，上机测。没有用RAN酶，我不知道，是不是这步可以省略？如果一定需要，不知道您在哪买的RNA酶呢？

olddream520: 其实空气中倒处都有RNA酶，如果实验不是要求很高的话可以不用，而且这个东东比较贵，10 mg/ml大约是310左右，只有1ML，不过应该够用了，所以我建议你先不加试做一下，结果不好再加吧

XTYang: PI可以同时染DNA 和RNA,所以必须用RNase把RNA水解掉以免干扰结果。

handshealing: 做流式要用RNAse的，可以和PI一起加，最好在37度闭光30分钟，这样做出来的结果会很好，至于加多少，一般500微升加10微克。

zzzyyy1977: 我最近要做线粒体、细胞骨架和核的荧光染色，买的是mitotraker FM green ,Rhodamine-phalloidin和PI,请问可以同时染色吗？

lplc：用PI作核的复染剂我感觉不是十分合适，Rhodamine-phalloidin和PI荧光都是红色。

hwb：

1、制备2×106/ml细胞悬液：弃细胞原培养液，加入5mlPBS，吹打成单细胞悬液，200—400目尼龙筛过滤。（30min）

2、乙醇法固定：将单细胞悬液离心（1000rpm，5min），弃上清液，重悬浮于1ml 4℃预冷的盐水G中，缓慢加入－20℃预冷的95％乙醇4ml，使其终浓度为70％，冰浴30min。（20min）

3、加100 5mg/mlRNase溶液，37℃保温30min。然后，冰浴终止酶作用。（35min）

4、1000rpm，5min离心，弃上清。（5min）?

5、用3ml PI染液（50 g/ml）重悬细胞，4℃，避光染15min。（20min）?

6、加入200  l异硫氰酸荧光素染液（1? g/ml乙醇溶液），4℃，避光染10min。（10min）

7、1000rpm，5min离心，弃上清。再用蒸馏水离心（1000rpm，5min）洗1次，悬浮于2ml生理盐水中。（15min）

8、进行FCM分析。DNA被PI着色，呈红色荧光，蛋白质被FITC着色呈绿色荧光。

上面是我的操作步骤。今天上了一次流式，但是FITC没有信号，是否我的FITC量太少了？在第5步之后再加加一步离心去上清怎样？然后再加FITC，但是FITC的浓度如何呢？

midas：可以试一试把FITC的加大10ug/ml试试！先加FITC后加PI，等全部反应完后，统一一次性离心！

hwb：我加的200微升的FITC浓度是20微克/ml的，终浓度是1微克/ml，您的意思是让我把终浓度提高到10微克/毫升？

midas：是的！

shangyan1979：PI是染死细胞的，我想问，染过的死细胞，是否还能再被染上？

小于：那要看你先用什么染细胞的了，PI与DNA和RNA都能结合的。我先用荧光染，然后用PI染色是没用问题的。