二、操作步骤

（一）冻存

1、消化细胞（同实验二），将细胞悬液收集至离心管中。
　　2、1000rpm离心10分钟，弃上清液。
　　3、沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5×106/ml左右。
　　4、将悬液分至冻存管中，每管1ml。
　　5、将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。
　　6、贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。
　　7、按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟）→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱（-30℃ 1小时）→气态氮（30分钟）→液氮。

注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30立升的液氮能用1～1.5月。

（二）复苏

1、准备一个茶缸或1000ml的烧坏，内装2/3杯37℃的温水。
　　2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。
　　3、打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。
　　4、1000rpm离心10分钟，弃去上清液。
　　5、沉淀加10ml培养液，吹打均匀，再离心10分钟，弃上清液。
　　6、加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，37℃培养，第二天观察生长情况。

三、试剂和器材

器材：液氮罐、冻存管（塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶）、离心管、吸管、离心机等

试剂：0.25%胰酶、培养基、含保护剂的培养基（即冻存液）

附：冻存液配制：

培养基加入甘油或DSMO，使其终浓度达5～20%。保护剂的种类和用量视不同细胞而不同。配好后4℃下保存。

二、建立细胞系（或株）的要求

什么样的体外培养群可被认可为己鉴定的细胞，视具体情况而定，无统一规定。对于用作原代培养的细胞只要供体均一，取材部位及组织种类等条件稳定即可，如用做长期培养，特别是反复传代的细胞，常需做如下说明：

1、组织来源：细胞供体所属物种，来自人体或者动物；
　　个体性别、年龄；取材的器官或组织。
　　如系肿瘤组织，应说明临床和病理诊断，以及病历号等。

2、细胞生物学检测
　　了解细胞一般和特殊的生物学性状，如细胞一般形态，特异结构，细胞生长曲线和分裂指数，倍增时间，接种率等。
　　如为肿瘤细胞，为说明来源于原肿瘤组织并保持恶性，须做软琼脂培养，异体接种致瘤和对正常组织侵润力等实验。

3、培养条件和方法；应说明细胞系（或株）适应的生存环境，即指明使用的培养基、血清种类、用量以及适宜PH值。

三、若干细胞建株的要点及基本过程

（一）肿瘤细胞培养技术要点

1、取材：材料主要来源于外科手术或活检瘤组织，取材时避免用坏死组织，要挑选瘤细胞集中和活力较好的部位，瘤性转移淋巴结或胸腹水是较好的培养材料。取材后尽快培养，因故不能立即培养者，可冻存。其培养方法及冻存方法同前述正常组织。

2、成纤维细胞排除：在肿瘤组织中常混杂有一些成纤维细胞，培养时能与瘤细胞同时生长，并常压过癌细胞，导致癌细胞生长受阻以至消失，应仔细排除。

排除方法常有：机械刮除法、反复贴壁法、消化排除法、胶原酶消化法等。

3、提高肿瘤细胞培养存活率和生长率：根据实验经验，肿瘤细胞在体外不易培养，建立能传代的肿瘤细胞系更为困难。一般当肿瘤组成或细胞被原代培养后，要经过对新环境的适应才能生长，因此不能局限于一般培养法，须采用一些特殊措施。如：用适宜底物，鼠尾胶原底层及饲细胞底层等。用细胞生长因子，根据细胞种类不同选用不同的促细胞生长因子，如胰岛素、氢化可的松，雌激素等。也可以考虑动物媒介培养。

（二）人类淋巴母细胞建株方法

1、4ml肝素抗凝血于离心管中，加入2ml RPMI 1640。
　　2、混匀后沿管壁缓慢加到预置有4ml淋巴细胞分离液的液面上静置30min。
　　3、1500rpm，15min，吸取白细胞层（第二层）于另一离心管中。
　　4、加RPMI 1640 5ml洗涤白细胞两次。
　　5、将白细胞接种至1ml RPMI 1640培养基中，加入10μl环胞霉素和100μl的EBV（EB病毒）液，混匀。
　　6、水浴摇床，40次/分，37℃，3hr。
　　7、1500rpm，15min。将细胞接种至1ml培养基中（内含谷氨酰胺1mM/ml）加入10μl环胞霉素，轻轻混匀，37℃培养。
　　8、5天后观察细胞转化和生长情况，决定是否半量换液。一般半量换液l～2次，并维持环胞霉素的浓度。
　　9、待转化细胞数量明显上升，并出现细胞团块后，可转入25ml细胞培养瓶中，加1～2ml培养基，37℃培养10～15天，一般每隔3～4天观察一次，决定是否换液，传代。
　　10、细胞生长达一定数量后冻存，冻存前应进行核型分析和存档。