实验步骤：

1、EB病毒液的制备

复苏B95.8细胞株，使用培养基为10% FCS RPMI-1640

逐步添加培养基至细胞长至对数生长期

细胞计数，调节细胞数量为1×10^6个/ml

在CO₂培养箱中继续续培养10天，中间不换液

至第10天收集培养上清，1800rpm，4℃离心15分钟

0.22μm滤器过滤，1ml/支分装，冻存于液氮备用

2、病人外周血液的采集、分离

使用枸橼酸钠抗凝管采集恢复期病人外周血10ml，尽量在24h内进行分离

平衡盐(BSS, balanced salt solution)溶液配制(请具体参见淋巴细胞分离液使用说明)：

Solution A

Anhydrous D-glucose 0.1 percent 1.0 g/l

CaCl₂ × 2H₂O 5.0 × 10-5 M 0.0074 g/l

MgCl₂ × 6H₂O 9.8 × 10-4 M 0.1992 g/l

KCl₅.4 × 10-3 M 0.4026 g/l

TRIS 0.145 M 17.565 g/l

Dissolve in approximately 950 ml distilled water and add

10 NHCl until pH is 7.6 before adjusting the volume to 1 litre.

Solution B

NaCl₀.14 M 8.19 g/l

*To prepare the BSS mix 1 volume SolutionA with 9 volumes solution B. Prepare the solution fresh each week. Other standard salt solutions may be used.

① 取病人外周血4ml+4mlBSS，混匀

② 各取4ml缓慢加入含有3ml淋巴细胞分离液Ficoll PLUS-Paque（GE Healthcare Bio-Sciences货号:71716700,使用前，充分混匀）的10ml离心管中（分两管进行）

③ 400g，18℃，离心30min

④ 小心吸取上层血浆，保存备用，避免扰动细胞。

⑤ 小心吸取淋巴细胞层至新的15ml离心管中

⑥ 加入6mlBSS，以吸管轻轻重悬细胞

⑦ 100g，18℃，离心10min，弃上清

⑧ 以8mlBSS再次洗涤一遍，离心，弃上清（重悬同时进行细胞计数）

(一般1ml血能分离出1×10^6个细胞，故4ml血约有4×10^6个细胞)

3、EB病毒转化淋巴细胞

① 取EBV上清1ml重悬上述细胞，37℃水浴，2h，20min晃动一次

② 加入3ml 20％FBS-1640全培，含0.2 μg/ml cyclosporin A （环孢素A Sigma Product No. C1832 ）

③ 分两孔，2ml/孔加至24孔板中（如果分离的血量大，请酌情考虑加入25cm²培养瓶中培养），37℃，5％CO₂培养。

④ 一般24h后即可见到细胞聚集成团生长，3-5天可见液体PH值发生变化，呈橙黄色，早期视情况补液，待细胞生长良好再采用半量换液（培养基为20％FBS-1640全培，含0.2 μg/ml cyclosporin A）

⑤ 一般15天左右即可建立稳定生长的淋巴母细胞。