混合胶质细胞培养来源于1-2天的大鼠，如同星形胶质细胞培养，有轻微的改动。乳鼠断头后大脑收集在DMEM-Ham‘s F-12含有1%抗菌素的溶液中。除去脑膜，血管和白质后，用机械匀浆法将大脑皮层匀浆，然后将细胞悬液依次通过230μm和104μm孔径的钢网过滤，然后用离心法收集细胞，用小胶质细胞条件培养基重悬细胞。条件培养基的成分：DMEM-Ham’s F-12培养基，添加2mM L-谷氨酸，1mM 丙酮酸钠，1×非必须氨基酸，10%胎牛血清和0.5%双抗溶液。然后接种到培养皿中。

小胶质细胞的分离：混合胶质细胞培养21天后，小胶质细胞通过轻微的胰蛋白酶化作用得到。胰蛋白酶1:3溶解于DMEM-Ham`s F-12 45-60分钟。胰蛋白酶化作用导致上层含所有胶质细胞的细胞层解析，而小胶质细胞仍然吸附在培养皿的底层。含有上层裂解细胞的培养基用气体吹掉，换入新的小胶质细胞条件培养基。胰蛋白酶化作用24小时后，分离出来的细胞可用作毒性分析。