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磷酸钙细胞转染技术

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[实验目的]

1 了解细胞转染技术原理和基本方法

2 磷酸钙沉淀法的基本技术要点

[实验原理]

磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法,磷酸钙被认为有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞,被转染的DNA可以整合到靶细胞的染色体中从而产生有不同基因型和表型的稳定克隆。这种方法首先由Graham和vander Ebb使用,后由Wigler修改而成。可广泛用于转染许多不同类型的细胞,不但适用于短暂表达,也可生成稳定的转化产物。

[仪器、材料和试剂]

1 呈指数生长的真核细胞(如HeLa,BALB/c3T3,NIH3T3,CHO,或鼠胚胎成纤维细胞)

2 完全培养液(依所用的细胞系而定)

3 CsCl纯化的质粒DNA (10~50μg/次转染,二次纯化)

4 2×HEPES缓冲盐水(HeBS)(pH6.95~7.05) 50.0mmol/L HePes;280mmol/L NaCl;10mmol/L KCl;1.5mmol/L葡萄糖。用0.5mmol/L NaOH调pH至6.95~7.05,过滤除菌后,-20℃保存备用。

5 2.5mol/L CaCl2过滤除菌,-20℃保存备用。

6 磷酸缓冲盐水(PBS)

7 37℃,5%CO2的加湿培养箱

8 100mm组织培养平板

9 15ml锥形管

[方法与步骤]

1 传代细胞准备 细胞在转染前24h传代,待细胞密度达50%~60%满底时即可进行转染。加入沉淀前3~4h,用9ml完全培养液培养细胞。

2 DNA沉淀液的准备 首先将质粒DNA用乙醇沉淀(10~50μg/10cm平板),空气中晾干沉淀,将DNA沉淀重悬于μL无菌水中,加50μL2.5mol/L CaCl2

3 用巴斯德吸管在500μL 2×HeBS中逐滴加入DNA-CaCl2溶液,同时用另一吸管吹打溶液,直至DNA-CaCl2溶液滴完,整个过程需缓慢进行,至少需持续1~2min。

4 室温静置30min,出现细小颗粒沉淀。

5 将沉淀逐滴均匀加入10cm平板中,轻轻晃动。

6 在标准生长条件下培养细胞4~16h。除去培养液,用5ml 1×HeBS洗细胞2次,加入10ml完全培养液培养细胞。

7 收集细胞或分入培养皿中选择培养。

[注意事项]

1 在整个转染过程中都应无菌操作。

2 为获得最佳实验结果,DNA应不含蛋白质和酚。乙醇沉淀后的DNA应保持无菌,并在无菌水或Tris EDTA中溶解。

3 沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在磷酸盐溶液中加入DNA-CaCl2溶液时需用空气吹打,以确保形成尽可能细小的沉淀物,因为成团的DNA不能有效地粘附和进入细胞。

4 在实验中使用的每种试剂都必须小心校准,保证质量,因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都可能导致磷酸钙转染的失败。

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