PC12传代的消化

生命经纬wangpengljr的问题：

我最近养PC12细胞做分化方面的研究，但是遇到的难题是PC12细胞本身的贴壁能力就差（养PC12细胞最好是用Gibco的马血清，Hyclone的不贴壁！），最开始没有用胰酶处理，直接吹打下细胞发现成团现象，用0.02％EDTA的PBS吹打似乎不易成团，但是慢慢地细胞贴壁能力下降了，我用poly－Lys包被都不行。我之所以不用胰酶是因为怕胰酶的处理会影响我以后的NGF诱导分化的实验，难道非得要我用胰酶吗？？那么该用多大浓度合适呢？

生命经纬yaya0011的回答：

这个细胞我正在养，一开始养的也不好，不容易贴壁，现在可健康了^_^ 因为细胞是从其他lab拿来的，所以我用的条件不是atcc上说得那个，我用6％fbs和6％马血清加dmem养，全部都是Gibco的。

培养条件试了很多，最后发现7。5％co2 是最好的。你可以试试。当然5％也可以，但是长得慢，所以我最后选了7。5，一般3天subculture。

加马血清似乎是因为里面有某种fbs中没有的营养物质，总之一定要加！

用trypsin后PC12会不健康，所以有二个办法。1。每次用完trypsin后1000rpm离心3min。将trypsin吸走。2。每次subcuture时候不用trypsin,和PBS，直接用medium把贴壁的细胞吹下来吹成单个的再长。我用的是后面一种，效果非常好。细胞很健康！

PC12健康与否的判断方法（是我自己总结的）：

没有加NGF时，如果细胞很健康，会长出很短的小轴突，整体圆圆的，很可爱。 当它不健康时，你会发现，1，细胞不易贴壁了，会漂很多。2。细胞会呈现椭圆形，轴突变长（这时的细胞其实状态已经不好了，即使贴壁也不行！）

用说得可能不清楚，我发张pc12的pic给你看。

PC12细胞间的聚集成团问题

生命经纬oscar2006的问题：

本人从中科院上海细胞所购得的未分化的PC12细胞，用F12培养基（含15%的马血清，2.5%的胎牛血清），培养时发现细胞呈粘附的聚集状态，即使吹散了，过夜培养后又出现聚集状态，而不是单个细胞的状态，这是不是未分化的PC12细胞所特有的状态？这种状态能不能种24孔板作药理实验？通过什么方法可以消除此状态？最好是对细胞损伤较小的方法

还有传代时如果按照1：3传代，剩余的瓶中的未分化的PC12细胞不容易贴壁生长了，是不是应该将长满的PC12细胞按1：3比例传到用多聚赖氨酸包被过的两个新瓶中？

生命经纬sq168的观点：

我自己的经验，PC12细胞的生长密度在70-80%时，就可以传代了，如果等长到很密的时候，好多细胞会出现分化的状态，不是很适宜做下一步的实验呢。再有如果你的细胞是分散的密集，是不是传代时的密度不够呢，可以试一下1:2传代。

关于做PC12细胞的MTT时遇到的问题

生命经纬omician的问题：

PC12在已用0.1 mg/mL poly-L-Lysine包被的96孔板中经NGF处理分化后2-3天后，吸弃培养液，加PBS洗涤（用于做后续处理），总会致使细胞大量丢失，尤其是孔中央那块。不知有没有什么好方法能解决这个问题。（注：未分化细胞吸弃培养基没有这个问题）。

另外，大家在用最近一批Hyclone Equine serum（马血清）时PC12的培养有没有聚团漂浮的问题。我最近换了四次不同公司代理的Hyclone马血清（均是在Aug/2008~Mar/2009左右到期），无论灭活还是不灭活PC12总出现这个问题。而用我以前仅剩的一瓶Aug/2008到期的马血清细胞却生长良好。现在这瓶也快用完了，而订Gibco的要一个月，真不知该怎么办了。（PC12一直是以Hyclone 1640+10%Hyclone equine serum+5%Hyclone fetal bovine serum培养的）

生命经纬dabao的观点：

PC12细胞我以前经常做相关试验。你所述现象我以前也有碰到过，后来注意以下几点，或许有可能改善。

（1）PBS可能过冷。分化后PC12细胞生长一段时间后贴壁能力有些会减弱，尤其板中间生长密集处或者培养时间稍长。此时，若用刚从冰箱中取出的PBS冲洗，很可能造成细胞脱落。

（2）PBS冲洗时一定不能用枪向孔中央直接大力吹打，很容易造成细胞被吹掉。

结合以往经验，建议：

（1）PBS自冰箱取出后置室温20～30min，然后使用。

（2）用滴管或枪头研孔壁慢慢加入PBS。

（3）也可以尝试用预热无血清培养基进行冲洗。

生命经纬syschenxiang的问题：

我正在作PC12 的MTT。在MTT的最后两步。即加完MTT四小时后，要将培养液吸出，然后加DMSO。但是PC12贴壁不严，吸出培养液时，很容易将其吸出。本人小心再小心还是不可避免。还有，也试过轻轻翻转过来，可是底部的细胞明显的随着液体的流动而流动，用劲小也无济于事。

生命经纬Xray的观点：

有些离心机可以离心96空板，离心后细胞应该就不会容易被吸出了

PC12的检测指标

生命经纬淡蓝色的鱼的问题：

PC12细胞模拟的神经细胞损伤检测时，除了MTT法，还有其他指标吗

生命经纬zengtony的观点：

可以检测神经保护相关的一系列指标，如ＬＤＨ（乳酸脱氢酶）的漏出率，过氧化损伤系列指标（ＳＯＤ，ＭＤＡ，活性氧等），游离钙浓度，细胞凋亡，神经递质的释放（如多巴胺等），关键是看你所用的干预因素的性质。