一、目的

MDCK细胞培养是分离流感病毒及相关研究实验的基本技术。疾控中心的所有技术人员，必须按照本文件相关的操作规程进行操作。

二、适用范围

适用于疾控中心所有技术人员 。

三、程序

（一）生物安全要求

实验室生物安全级别：BSL-1

所有操作必须在BSL-1实验室的生物安全柜里进行。

（二）材料

1. 生长成片的MDCK细胞

2. 无菌的T25细胞培养瓶

3. D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺）

4. 青、链霉素母液（10000 U/mL青霉素G；10000µg/mL硫酸链霉素），分装后保存于-20℃

5. HEPES缓冲液，1M母液

6. 胎牛血清

7. EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mM EDTA-4Na），分装后保存于-20℃

8. 7.5%牛血清白蛋白组分V

9. 1mL、10mL无菌移液管

10. 70％～75％的酒精

注意事项：经常检查试剂使用的有效期。

（三）实验步骤

这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。

1. D-MEM培养液的准备

500mL D-MEM液中加入：

青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素），

HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。

7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL

2. 细胞生长液的准备

胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。

3. 首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。

4. 温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA胰酶。

5. 重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。

6. 加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。然后加入1mL胎牛血清灭活残余的胰酶。

7. 加9mL已经配置好的含有L-谷氨酸的D-MEM培养液，轻轻用移动移液管来吹散细胞团。

8. 取10mL混合物加到90mL细胞生长液（细胞悬液的浓度大约为每毫升含105细胞）

9. 每个T25细胞培养瓶加入6mL（6×105/mL）细胞悬液，剩余的细胞悬液可以加到T75细胞瓶用于细胞传代。通常6mL细胞悬液2～3日可生长成片（80％～90％）的单层细胞。

10. 于37℃，5%CO2培养箱里培养细胞，每天观察细胞状态，以供进一步实验用。