在真核细胞中表达蛋白的步骤比大肠杆菌复杂得多。首先要考虑选用什么载体。一般人们趋向于使用分泌表达载体,以便于蛋白的纯化。但有的蛋白并不适合于分泌表达,如一些胞质蛋白,非糖基化蛋白等。此外分泌表达的蛋白信号肽存在一个效率问题。有的蛋白即使存在信号肽,也不能分泌。并且有的分泌蛋白较易受到蛋白酶的降解。所有这些因素都需综合考虑。 1、克隆 选用合适 的内切酶把外源基因克隆于表达载体的多克隆位点。如果选用的是分泌型表达载体,则外源基因的阅读框架和信号肽的阅读框架应该保持一致。 2、重组栽体线性化 重组载体只有被酶切线性化整合效率才能大大提高,环状质粒整合效率是很低的。选用不同的内切酶线性化可得到不同的转化子。如对载体 pPC19选用BgiⅡ线性化,转化后可得到Muts表型转化子;选用SaI或StuI线性化,转化后可得到Mut表型转化子。 3、转化 目前对真核细胞的转化方法有多种,例如对于P.Pastoris的转化目前有4种方 法:①锂盐法;②PEG法;③原生质球法;④电穿孔法。锂盐法和PEG法方法简便,但效率很低,每微克DNA只有几十个转化子或更低,一般不多用。原生质球法和电穿孔法转化率都较高,而且一般可得到高拷贝重组,其转化率都可达到105/μg。但原生质球法操作繁琐费时;电穿孔法简便、快速、高效,是理想的转化方法。选用上述四种方法中的一种转化。一般选用原生质球或电击法。 4、筛选 转化子可先在不含组氨酸的培养基上初筛。复筛可用PCR进行。即提取转化子DNA,用外 源基因两侧特异引物扩增筛选。然而,这只限于少量转化子转化子太多,则工作量太大。对于大量转化子的筛选.可用原位点杂交进行。即把相同量的不同转化子点在NC膜上,在原位对酵母细胞壁进行裂解,使之释放DNA。DNA经变性、中和后,可和由外源基因制备的探针杂交。用这种方法,在一张Nc膜上,可完成对几百个转化子的筛选。用原位点杂交不仅可以筛选大量转化子,而且可以鉴定多拷贝。这是因为当点到NC膜上的菌量相同时,转化子中外源基因拷贝数越多,则杂交后信号越强。 5、鉴定表型 筛选出的转化子需鉴定表型,以酵母为例,即确定是Mut+还是Muts。这两种不同表型在诱导表达的条件上有差异。可以把转化子同时点在MD和MM两块板上。在MD和MM板上生长差别不大的转化子为Mut+;相反,在MD上生长快,MM上生长很慢的转化子为Mutd。 6、诱导表达 外源蛋白在真核细胞中的表达分两步,即菌体生长和蛋白诱导表达。先在以培养基上培养菌体,达到一定OD值后,离心弃上清,菌体悬浮于以液体培养基中诱导表达。表达的条件有待优化,如通气状况,pH值,培养基的组成等等。一旦最佳条件确定,则可以按比例放大。从摇瓶培养转至大规模发酵。 |
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