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细胞周期的测定

标签: 细胞周期 测定

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一、原理

细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。

单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法,但它不能代表细胞群体的周期,故现多采用其他方法测群体周期。

测定细胞周期的方法很多,有同位素标记法、细胞计数法等,这里介绍一种利用BrdU渗入测定细胞周期的方法。

BrdU (5-溴脱氧尿嘧啶核苷)加入培养基后,可做为细胞DNA复制的原料,经过两个细胞周期后,细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占l/2,反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期,则染色体中约一半为两条单体均浅染,另一半为一深一浅。细胞如果仅经历了一个周期,则两条单体均深染。计分裂相中各期比例,就可算出细胞周期的值。

二、仪器、用品与试剂

1、仪器、用品:同常规细胞培养

2、试剂:BrdU(1.0mg/ml),甲醇、冰醋酸,Giemsa染液,秋水仙素,2×SSC液

三、操作步骤

1、细胞生长至指数期时,向培养液中加入BrdU,使最终浓度为10μg/ml。

2、44小时加秋水仙素,使每毫升中含0.1μg。

3、48小时后常规消化细胞至离心管中,注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。

4、常规染色体制片。

5、染色体玻片置56℃水浴锅盖上,铺上2×SSC 液,距紫外灯管6cm处紫外照射30分钟。

6、弃去2×SSC液,流水冲洗。

7、Giemsa液染色10分钟,流水冲洗,晾干。

8、镜检100个分裂相,计第一、二、三、四细胞期分裂指数。

9、计算:

细胞周期(Tc)=48/{(M1 2M2 3M3 4M4)/100}(小时)

附:(1)BrdU配制: BrdU 10mg十双蒸水10ml 4℃下避光保存。

(2)2×SSC配制: NaCl 1.75克,柠檬酸三钠•2H2O 0.88克,加水至100ml,4℃保存。

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