支原体菌株来源: M.Arginini ATCC23838 精氨酸支原体 M.FermentaneATCC19989发酵支原体 M.SalivariumATCC23064唾液支原体 M.HominisATCC23114人型支原体 M.OraleATCC23714口腔支原体 M.HyorhinisATCC29052猪鼻支原体 其共同引物序列来自16s和23s保守区域,外部引物为F1 5′-ACACCATGGGAGCTGGTAAT-3′,R1 5′-GTTCATCGACTTTCAGACCCAAGGCAT-3′;内部引物为 F2 5′-GTTCTTTGAAAACTGAAT-3′,R2 5′-GCATCCACCAAAAACTCT-3′。
PCR反应体系和条件:10×缓冲液(10mMTris-HCl、500mMKCl、20mMMgCl2、0.01%明胶)、PrimerF1、R1、F2、R2的浓度为2nmol/μL、2.5mMdNTPs、Taq酶、H2O、石蜡油覆盖。反应温度和时间为:94℃/2min预变性、94℃/30s变性、55℃/1min退火、72℃/1min延伸,循环30次后72℃延伸5min。第1次PCR反应取模板10μL,第2次PCR反应以第1次PCR扩增产物为模板取1μL。
下面是更详细的:
污染测试——支原体:PCR方法
原理: 利用具特殊专一性之primers,经由PCR反应来复制mycoplasma DNA。所用之primers来自mycoplasma之conserved 16S-23S rRNA序列,由于此段spacer之序列依mycoplsma种类不同而不同,因此可依所复制之DNA大小及其restriction fragment大小差异来作侦测与鉴定。
特点:灵敏(e.g. 0.1~1.6 CFU / 5 ul sample) 与快速(一天)。可侦测不易培养之mycoplasma (e.g. M. hyorhinis)。不需培养mycoplasma作为正反应对照组,避免可能之污染。
缺点:PCR反应很灵敏,易有伪阳性结果。此方法尚在评估中,故结果仅作为参考和内部品管之一部份。
材料与设备: ATCC mycoplasma detection kit:可作50~100 reactions. 提供1st stage primer mixture与2nd stage primer mixture positive control DNA (A. laidlawii ; M. pirum) PCR reagents : Taq polymerase ( 5 U / ul ) dNTP( dGTP, dCTP, dTTP, dATP, 1.25 mM each ) 10x PCR buffer (with 1.5mM MgCl2) 25mM MgCl2 sterile ddH2O Machine / Equipment: PCR thermal cycler agarose电泳设备 DNA电泳胶体观察设备 无菌PCR反应管 无菌1.5 ml微量离心管 无菌2ul, 20ul, 200ul, 1000ul Tips/ Pipetmans
方法: 此PCR反应是一种nested PCR,包括2阶段PCR反应,1st stage PCR结束后,取其反应物作2nd stage PCR,然后取2nd PCR产物作agarose gel electrophoresis,依DNA band之有无及片段大小来分析结果。 结果:使用UV light观察,并照相记录。
不过应用较多还是巢式PCR
方法:此PCR反应是一种nested PCR,包括2阶段PCR反应,1st stage PCR结束后,取其反应物作2nd stage PCR,然后取2nd PCR产物作agarose gel electrophoresis,依DNA band之有无及片段大小来分析结果。
结果:使用UV light观察,并照相记录。
方法再详尽点:st stage PCR reaction(total volume 25 ul): 测试样品 ( 2 ul / each ) 直接取样测试细胞之培养液。 Positive control : mycoplasma DNA ( A. laidlawii ; M. pirum ) Negative control : ddH2O Reaction mixture ( 23 ul / each ) 10x PCR buffer (含1.5 mM MgCl2 ) 2.5 ul 1st stage primer mixture 0.5 ul dNTP ( 1.25 mM each ) 1.0 l MgCl2 ( 25 mM ) 0.5 ul Taq DNA polymerase ( 5 U/ul ) 0.1 ul ddH2O 18.4 ul
PCR program ( 1st PCR与2 nd PCR相同):使用PCR thermal cycler step 1 : denaturation: 94 ℃ 30 sec step 2 : denaturation: 94 ℃ 30 sec step 3 : annealing: 55 ℃ 2 min step 4 : extension: 72 ℃ 2 min 重复3.1.3.2至3.1.3.4步骤30 cycles step 5 : final extension 72 ℃ 5 min
2 nd stage PCR reaction(total volume 25 ul) 测试样品:1st stage PCR product(1 ul / each)。 Reaction mixture ( 24 ul / each ) 10x PCR buffer (含1.5 mM MgCl2 ) 2.5 ul nd stage primer mixture 0.5 ul dNTP ( 1.25 mM each ) 1.0 ul MgCl2 ( 25 mM ) 0.5 ul Taq DNA polymerase ( 5U/ul ) 0.1 ul ddH2O 19.4 ul PCR program同3.1.3;使用PCR thermal cycler
胶片电泳分析 胶片 (2.0%) 置备: 将2 g agarose溶于100 ml ( 1x ) TAE buffer。 电泳液:(1x) TAE buffer(Tris-acetate/EDTA electropheresis buffer) 选择100~500 bp DNA size Marker:取100 bp ladder Marker 5 ul ( 25 ng/ul ) 取10 ul 2 nd stage PCR产物分析,各加入2 ul ( 6x ) loading dye。 进行电泳分离100V, 25 min。 胶片染色:ethidium bromide染色10 min,H2O退染10mim。(EtBr为致癌物质,请戴手套并小心操作) 结果:使用UV light观察,并照相记录。
Figure Agarose gel electrophoresis of the 2nd -stage PCR Products from eight commonly encountered Mycoplasma and A. laidlawii Species. ( from ATCC mycoplasma detection kit)
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