Percoll密度梯度离心分离法: 1、Pcrcoll混悬液的配制:Percoll 90ml,HBSS 9ml, HEPES(0.25mol/l)1ml(PH 7.3),HCL(1mol/l)0.4ml 调节至PH7.4 2、制备Percoll密度梯度管 密度 Percoll/HBSS(ml/ml) 1.070 24:20 1.079 27:15.9 1.088 23:10 3、加分层液的顺序:底层先加4ml 1.088g/mlPercoll液,第二层加4Ml1.079g/mlPercoll液,嘴上曾加3ml 1.070g/ml的Percoll液,制成3个密度梯度管,用于分离碱性粒细胞。 4、将新鲜的抗凝血(用0.1mol/lEDTA PH 7.7抗凝)按等体积加于Percoll密度梯度分层液上,室温下1200r/min离心25分钟。 5、将每一细胞层分别吸出各放于1支试管内,加无Ca,Mg离子的Hanks液在4度下洗涤3次,每次1200r/min,离心10分钟弃去上清。 6、将分别得到的各层细胞涂片,固定后用Wright-Giemsa染液染色,在显微镜下检查嗜碱性粒细胞(大多数在中间层,但不同个体嗜碱性粒细胞的密度不同,因此可能会出现在其他细胞层),嗜碱性粒细胞染成紫红色。 |
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