器械: 饭盒、烧杯、弯头解剖剪(2)、小镊子(2)、平皿(4)、毛玻片、滤网、离心管(15ml)、移液管、培养瓶、废液缸、PE手套、橡胶手套、冰盒 溶液: PBS、DMEM(含血清)、DMEM(free)、胰酶 动物: 小鼠 准备: 用酒精棉球擦拭台面后把物品摆放好,开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束,提前半小时将培养液、胰酶37℃温浴。 培养过程: 1、两个圆皿中加入5ml的PBS培养液,将小鼠浸入70%酒精<5min,用小剪子及小镊子开胸取心。 2、取出的心放在一个装有PBS的平皿中,剔除心脏周边的血凝及纤维组织。 3、PBS再冲洗后,转移至另一个预先装好5ml胰酶的平皿中,用剪子将平皿中的心脏剪成1mm3的碎块,倒入15ml离心管中,加入3-5ml胰酶冲洗平皿转移到离心管中。 4、放入水浴锅中,温和摇动,10min,自然沉淀,小心吸取上清,上清中主要是血红细胞、细胞碎屑和死细胞。 5、再将8-10ml胰酶加入盛有组织的离心管,吸管轻轻吹打1min,消化10min,小心转移上清+2ml DMEM至另一离心管中,细胞悬液离心,1000转×10min,弃上清,加培养基为管1。 6、重复第5步,3-8次,直至至组织块消化为止。 7、将多次细胞悬液经100目滤网过滤,混合。 8、加入1ml DMEM重悬,显微镜下观察并计数。 9、培养1-1.5小时,收集培养液中的非贴壁细胞,小心不要晃动。 10、显微镜观察并计数,细胞密度调至5×105-6×105细胞/ml。 11、4-6小时后,用培养基轻轻冲洗2次,加入培养基继续孵育过夜。 或从第5步起,加胰酶10-15ml,30min 37℃水浴,每5min用吸管吹打5ml完全培养基终止。 |
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