Marc 145细胞培养和维持有关资料综述 一、 细胞及培养 1、Marc145细胞 上皮样细胞,来源于猴肾细胞,从母细胞(MA 104细胞)克隆而得到,可连续培养。 2、生长培养基 DMEM(高糖型,含4500mg/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺,和110mg/L丙酮酸钠,不含碳酸氢钠)+5-10%新生牛血清+ 1%双抗(青霉素和链霉素)的培养液。 3、冻存液 生长培养基+10% DMSO 4、细胞健康生长的几项注意事项 (1)细胞没有支原体等外源因子的感染。 (2)培养液的pH值可在7.0-7.3,以7.2为佳。 (3)一般按1:3传代,细胞接种密度为1-1.5×105cells/ml,48hr后长成单层。 (4)培养基和血清的质量可靠、稳定;建议采用特级小牛血清。 (5)细胞及时传代,不可以在老化后传代,一般在刚长成细胞单层时进行传代、扩增。 (6)细胞传代时消化液用0.25%胰蛋白酶+0.03%EDTA,消化过程应尽量缩短在1~2分钟内完成。 二、 病毒感染、维持和收获 转瓶中细胞长成单层后,弃瓶内细胞生长液,接种PRRS病毒。37℃吸附1hr,加入维持液,置37℃恒温室转瓶机上旋转培养3-5天。 维持液:DMEM+4~5%新生牛血清。 pH应为7.4~7.8;后期维持pH会慢慢降下来。 细胞病变时间出现在接毒后48小时,72~96小时细胞病变达80%左右,当细胞出现80%以上病变(CPE)时,即可开始收毒;反复传过几代后病变时间可缩短。 第3、4天注意观察,细胞病变(CPE)达到80%时收获病毒,-20℃冻融3次,混匀病毒悬液,96孔板测定TCID50。 收液时需要将含毒细胞反复冻融2~3次以破碎细胞,将病毒释放到培养液中。 三、 细胞病变(CPE) 细胞在接种病毒后,24-48hr开始出现病变,72-96hr约达到80%病变。病变现象:细胞空泡化、圆缩、先灶状脱落,再大片脱落,最后整个细胞裂解、破碎。图1是指PRRSV感染后,出现细胞病变的Marc 145细胞。 四、 PRRS病毒在细胞中增殖规律( Virology Journal, 2006, 3: 90) PRRS病毒感染Marc 145细胞过程可大致分为两个感染阶段,第一阶段:病毒感染细胞后的20-22hr左右,仅部分细胞被随机感染,而且Marc 145细胞对PRRS病毒的低感染性(low permissiveness)与MOI量无关,因为MOI剂量比常规量提高100倍,感染22hr后,仍仅5.5%的细胞呈PRRSV阳性(PRRSV-positive)。第二阶段:感染后的2-3天(也称为病毒的对数感染期),病毒感染蔓延是通过相邻细胞和细胞之间的接触感染,细胞对自由病毒不敏感(Cells is nonpermissive to free Virus),并出现了感染细胞群。 感染过程如图5所示。 对我们的一点启示:可以采用适当低量的MOI进行病毒感染,比如0.05virus/cell;同时,大部分细胞在维持期的第一天尚需继续生长,而且病毒在2-4天才是感染、增殖的高峰,较长的病毒维持期均需要供给丰富的营养物资,可以相信:维持液的营养成分对病毒增殖效率有非常重要的影响。 |
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