paipaihe:24孔中,对已成功转染GFP的细胞进行免疫细胞化学检测 1抗使用GFP 单抗(鼠源) 2抗使用羊抗鼠的HRP标记2抗 经染色后未见任何阳性显色细胞, 请问各位可能的原因都有那些呢?
我的具体操作是 1.4%多聚甲醛固定30分 2.triton-100 透化 15分 3.3%H2O2/甲醛 10分 4.5%BSA 60分 5.1抗 60分 6.2抗 60分 7.染色 生命经纬网友byd123认为: 有几个问题: 1)如何知道是已成功转染GFP的细胞? 2)3%H2O2/甲醛10分? 应该是3%H2O2/甲醇30分 3)5%BSA 60分 改为1%BSA 30分 4)1抗60分 改为1抗过夜 5)2抗60分 是在37度吗? 6)染色 你用什么染色的?多长时间? 7)重要的是,你是否做过抗体的棋盘滴定? 一抗按比例稀释,1:200,1:400,1:800...... 二抗可选用推荐最高浓度 呵呵,这些问题搞清楚,才能知道原因 生命经纬网友paipaihe认为: GFP已在荧光显微镜下得到验证 我用的DAB染色方法 还有个问题,我的一抗浓度很高,过高的一抗浓度会影响结果吗? 生命经纬网友byd123认为: 一抗浓度很高,会加强非特异性染色的,所以抗体要做棋盘滴定的,找出一个最佳浓度,呵呵,这样,片子才漂亮。 |
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