以下是根据NIH老年病研究所提供的英文的R1胚胎干细胞培养protocol整理而成。根据经验作部分修改。 1、一般培养:保持胚胎干细胞处于未分化状态 培养基 2 、体外分化 培养基 体外分化方法 注:以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系,其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol,需要用专用的protocol和培养基。 一般培养 维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有LIF(白血病抑制因子)和Feed细胞的培养基(高糖)来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1%明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2-3天从达到80%-90%融合的平板按1:8的比率传代细胞一次,细胞传代以后,在将细胞接种在0.1%明胶包被的培养皿之前,通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时,使分化细胞粘附,从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃,5%CO2,100%湿度条件下培养。如果在Feed细胞,那么就需要采用MMC进行处理,抑制Feed细胞增殖,但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。 培养基 ES: 配制一20×不含DMEM,HS,LIF的溶液(该溶液也能用于EB培养基--见下文)。分装在50ml 离心管中,(稀释为2×,每管42ml),贮存在-20℃。通过将21ml该溶液,HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基,0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃,时间不要超过2周。 复苏细胞 细胞被冻存在10%二甲基亚砜(DMSO)中防止结晶的形成,结晶的形成会损害细胞。然而,二甲基亚砜对细胞有毒性,快速的进行细胞复苏是很重要的。 步骤: 冻存细胞 冻存液:90%HS和10%DMSO 步骤: Geltin(明胶)包被 准备500ml 0.1%geltin溶液 包被培养板或培养皿 细胞传代 建议每2天传代细胞一次,过度生长的细胞会降低细胞的自然分化率,我们建立了一种纯化方法来去除分化细胞,在将细胞接种在明胶包被的培养板上之前,通过将分化细胞黏附在没有包被的组织培养板上去除分化细胞。纯化步骤包含在下面的方法中。 1、去除培养液; 保持细胞的传代比率很重要,以我们的经验,1:8的比率是好的,可以使细胞的自然分化降到最低。当你使用不同规格的培养板进行细胞传代可以使用表1来计算传代比率。 |
体外分化 胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。我们的体外分化方法有利于神经前体细胞通过在最少量的培养基内选择(第3步),在有bFGF存在的情况下扩增(第4步)并最终分化在第5步。细胞全程培养在37℃,5%CO2,100%湿度条件下。一般体外诱导向神经细胞方向分化,也可以采用低浓度的RA进行诱导。 时间线(总时间为27~34天) 第2步;4+1天 第3步;4-10天 第4步;4天 第5步;10-15天 体外向心肌细胞方向分化 胚胎干细胞在体外去除LIF情况下会自然向心肌细胞方向分化,小鼠的R1系一般在第7-8天自然出现搏动的心肌细胞,与胚胎发育时间线是完全一致的。 培养基: 贮存液 配制一20×不含DMEM/F12的溶液。分装在15ml 离心管中,(稀释为1×,ITSFn 7.05ml,N3 12.55ml),0.2μm滤膜过滤,贮存在-20℃。将该溶液加入DMEM/F12中制备培养基,贮存于4℃。 贮存液 *在第4步将bFGF加入N3培养基使终浓度为10ng/ml。 ITSFn and N3培养基贮存液的准备 使用无菌的溶剂和稀释液,在分装之前要对溶液进行过滤,如果因为某些原因溶液在分装之前没有进行过滤,需要在管子上标明以便别人在使用时知道该溶液不能直接用于细胞培养。 贮存液 溶剂,贮存液,稀释剂和储存 包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板(使用或不使用盖玻片) 包被液的准备 包被过程: 24孔板用200μl,6孔板用500μl。震荡培养板确保溶液能够覆盖盖玻片或培养孔。有时需要剧烈震荡培养板。 |
体外分化方法 第1步:ES培养基 在LIF存在的条件下维持细胞培养 第2步:EB培养基 使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。 形成胚状体需要4天时间。在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织培养皿的表面。这一天被认为是第2步和第3步的分界。 第3步:ITSFn培养基 在最少量培养基中选择神经前体细胞 观察细胞形态,神经样细胞大约出现在第4到第7天。当神经样细胞能够被鉴别时,转入到第4步。步骤的转换应该在神经前体细胞出现第一个清晰的标志几天以后,通常是在第3步的第6到第10天。 第4步:N3培养基+bFGF 通过将神经前体细胞培养在含有10ng/ml bFGF的培养基中进行扩增。 第5步:N3培养基 通过撤除bFGF使神经前体细胞分化 细胞在胚状体形成4天以后被移植(相应于体外分化过程中的第2步末细胞被转种到组织培养板)。正如在前文体外分化中所描述的在移植之前4天开始形成胚状体。通常再需要一天时间以便将胚状体移植入一10cm的培养皿。 |
移植 1、将胚状体转移至一15ml 圆锥形管中放置3~5分钟使胚状体沉降下来。 2、去除上清将胚状体重悬于无钙镁离子的1×PBS中 3、离心3分钟 4、去除上清加入1×胰酶(10cm的培养皿加1ml) 5、37℃水浴5分钟 6、加入5mlEB培养基小心吹打约10次 7、离心2分钟 8、吸出上清将细胞重悬于500μl EB培养基 9、用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次 10、离心2次 11、吸出上清将细胞重悬于100μl EB培养基 烟酸己可碱标记ES细胞进行移植 1、准备一10μg/ml的烟酸已可碱染液(双苯酰亚胺,在冷冻室118) 2、加入1mg(你能称到的最小量)到5ml EB培养基(制成200μg/ml) 3、将溶液稀释成10μg/ml (100μl 200μg/ml 溶液和1.9ml EB培养基) 4、如前所述将细胞重悬于2ml烟酸已可碱染液而不是EB培养基中制备ES细胞悬液 5、将悬液置于室温(或冰上)30分钟 6、离心2分钟 7、吸出上清将细胞重悬于2ml EB培养基 8、重复一次 9、离心2分钟 10、吸出上清将细胞重悬于100μl EB培养基并置于冰上。 |
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