gdgznf2008：大家看看我的293细胞状态怎样？ 适合转染吗？

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生命经纬网友pmy5155714认为：

不太好至少你的细胞长的太不均匀了

而且有的细胞已经老化消化的问题

生命经纬网友gdgznf2008认为：

我的细胞是师兄冻存的，也不知多少代了，我用的是0.025的胰酶＋EDTA消化的，而且尽量吹打均匀，可接种后仍然长的不均匀，呈片状生长。我试的转染了，效率不高，还能不能用来转染做表达啊？ 望各位指点

生命经纬网友coffee1170330：

你怎么评价转染效率的那？效率大概多少？

生命经纬网友gdgznf2008：

我是通过大致估计细胞数来计算的，即荧光显微镜下细胞数与总的细胞数之比计算的，转染率约10%，质粒是去内毒素提的，浓度约1.0μg/μl，转染试剂是lipofectmin2000，想再试一次，细胞是师兄留下的，也不知几代了，想看看是不是细胞的原因。

生命经纬网友happycowcow认为：

首先你一定要明确代数，这一点很重要。转染的时候用低代的293细胞转染效率高。如果转染效率低，首先你就应该考虑293的代数太高了。我用腺病毒转低代的293细胞（第40代左右），转染效率几乎100%，用质粒转染293细胞的时候，转染效率至少20%。

另外，293细胞挺好养的，它贴壁很不牢，消化的时候我都是用自己配的大约0.125%的胰酶，不加EDTA，有时候发现胰酶不够了，干脆啥都不用，直接吹打就消化下来了。如果用EDTA，消化太快，很容易消化过头，消化太厉害也损伤细胞，影响细胞的活力。

生命经纬网友小熊猫0701：

请问大家做转染时，都是怎样处理质粒的阿？即对质粒的浓度，纯度有什么要求吗？最重要的，需要过滤除菌吗？

生命经纬网友南大一修认为：

质粒没什么特别要求，如果你有去内毒素的质粒试剂盒可以考虑用它，如果没有就用一般的试剂盒效果也不错，我们实验室用的是TaKaRa，Qiagen质粒提取试剂盒。一般小提试剂盒提出的质粒浓度是0.35μg/μl （需要电泳或分光光度仪上测定），纯度要求是OD₂₆₀/280>；1.8，转染前质粒不需要过滤除菌，不过值得注意的是转染用质粒需要用DDW溶解。

生命经纬网友小熊猫0701：

多谢南大一修的指教

我是用手提的，没用Kit，请问，DDW是指去离子水吗？

生命经纬网友hanxinjun32认为：

你的293细胞状态不太好，实际上293细胞很好养，你不应该用这种状态的细胞。可以再问别人要一株状态好的。293细胞用腺病毒做转染效率很高，MOI=100的时候，转染效率可以达到90%以上。

生命经纬网友anbieten认为：

细胞状态不好，应该在传代的时候调整浓度（可以先浓度大些），让细胞能长的单层密度大些，过几代以后再按固定比例进行传代，看是否有改善.或者传完后，过不久将没有贴壁的细胞弃去，留下的可能贴壁好些.

病毒是感染细胞，不应该叫转染细胞，有的时候可作为载体转导基因.总之，一般不应该与质粒转染混淆.

生命经纬网友fangfang2007认为：

293细胞的这种状态不适合做转染，转染成功与否，细胞状态很重要。我做转染时，细胞是师姐留下的，对于细胞的代数也不大清楚，开始时转染的效率很低20%，感染不成功，后来重新大题，第一次转染效率达到80%，我认为质粒也不要放太久。

293细胞状态好了，很好养。我是用0.25%的胰酶和EDTA消化的，加上酶后不要晃动，要不然细胞会成片的脱落轻轻的放在温箱里2-3分钟，看到细胞空隙变大成沙粒状，终止消化，稍吹打即可，离心。不要消化过了，细胞虽成单个，但不容易贴壁了。

生命经纬网友j510认为：

这个细胞状态还是很好的，看起来很健康，圆缩的死细胞很少，只是传代时没有将铺均匀而已，细胞培养代数影响转染，但我的经验这不是关键因素，起码不是首要的考虑因素，注意选取指数生长期的细胞即可，另外质粒的质量很重要，再就是转染方法的优化。供参考。

生命经纬网友远方的家乡认为：

我觉得你的细胞状态不太好，我也养过293细胞，很容易消化，我用0.1%的胰酶一两分钟就消化下来，不加EDTA。还有就是转染试剂对细胞的毒性问题，你的试剂没有问题吧。我以前做转染的时候，有的细胞对它很敏感。

生命经纬网友happycowcow：

为什么大多数人都感觉gdgznf2008的293细胞状态不太好呢？我养293细胞有一年多了，根据我的经验，gdgznf2008的细胞看上去还可以啊。我用质粒和腺病毒都转过293细胞，感觉挺容易的啊。

建议gdgznf2008：

1、我在转的时候，293细胞的融合程度一般在80-90%左右。感觉gdgznf2008目前细胞的融合度不够高。融合度太低或者达到100%都不利于转染。

2、我用质粒转293时，用的QIAGEN的FILTER那种试剂盒提的质粒，感觉QIAGEN的这个试剂盒很好，提的质粒比较纯。提的质粒纯度很重要。

3、在转染前的质粒DNA一定要用去离子水溶。

4、适当调整质粒DNA与lipofectamine的比例。如果你提的质粒比较纯的话，就参考lipofectamine 2000的说明书操作就可以了。我当时用的60mm的培养板，质粒DNA用的8μg，lipofectamine 2000用的20μl。

5、转染期间用无血清培养基。我用的是Opti-MEM I Reduced Serum Medium。

供参考。

生命经纬网友贱客认为：

细胞的形态还可以 可能是： 消化时没有吹打均匀； 也可能是传代太少了

如果这种细胞用作转染应该还可以，仅供参考。

生命经纬网友jessie0983认为：

实在很奇怪为什么那么多人说这个293的状态不好呢？根据我的经验这些细胞的状态还是很好的，但是密度太稀了，如果是这样的密度做转染肯定不行的！！！当然铺的均匀也是很重要的！！！

293很容易转染的阿！！！楼主要注意转染过程的细节哦~~~~

生命经纬网友南大一修认为：

DDW 是指双蒸水，我一般用灭菌后的双蒸水。

生命经纬网友jjjj2007认为：

293细胞状态很好，只是不太均匀.可以转染或者再传一代.

把细胞吹打后，显微镜下基本为单个细胞再铺在培养皿中即可.我不喜欢用胰酶消化.