1、做细胞爬片（爬片的步骤就不详述了），注意：洗片子的PBS和固定用的4%多聚甲醛一定要新鲜配制的（一周以内的都能用）， 因为PBS和4%多聚甲醛放久了后，都会有自发荧光。

2、抗体的孵育：预实验的时候荧光根据文献和经验设定一、二抗的浓度，一抗4度孵育过夜（时间8～12h）；二抗（荧光抗体）孵育时要避光，孵育好后用PBS充分冲洗；可以将做好的片子直接在板子中孵育，如果从节约的角度来看，可以用12或24孔板比较好。

3、做好以上步骤后，将板子里放点PBS，保存片子湿润，不要干片，这样会影响细胞形态。

4、到激光共聚焦观察室后，再将爬片取出，在干净的载玻片上滴一滴50%的甘油，然后将爬片取出来倒扣在滴过甘油的载玻片上（即细胞在2层玻片之间，一定不要反了哦；还有千万不要用中性树胶封片！

5、显微镜下观察即可。