近年来,RIA技术研究取得重大进展,其主要的特征是将纳米磁性微粒子作为载体,经共价键结合制备成固相抗体,最大限度地简化了操作程序,缩短了反应时间,并为实现完全自动化检测创造了条件,使经典的RIA技术焕发了生机和活力,被列为第五代RIA 技术。我们于2004年在国内首先开发这一技术的实验研究,先后研发出甲状腺系列、肿瘤标志物系列、性激素系列和糖尿病系列试剂盒,现将方法建立及有关问题作初步探讨。 一、标记物制备 (一)生物素化抗体按文献Eli方法制备,在双标记IRMA法采用标记纯化的McAbIgG,在竞争法采用标记纯化IgG。 (二)异硫氰酸荧光素(FITC)标记物采用微量透析法。标记的抗体依检测反应模式不同而异。 (三)标记物竞争法检测小分子化合物,标记物为抗原,双标记液相IRMA,标记物为McAb,标记方法按常规氯胺T氧化法。 二、磁性微粒子固相抗体制备 按照检测反应模式的不同,需要制备不同的磁性微粒子固相抗体],如固相一抗体,固相二抗体。 取直径800~2000nm 磁性微粒子(表面羧基化),用生理盐水洗涤。按1O倍量悬浮于生理盐水中,在缓缓振荡下加入适量抗体IgG ,立即按IgG对偶联剂2O倍(M:M )的量加入碳化二亚胺(EDC),在室温振荡下反应2h。再补加10倍量的EDC,移至4℃ 反应过夜。次晨,再经生理盐水充分洗涤,直至上清液经紫外分光光度计280nm 测量A 值大于0.02。最后加含有0.5 BSA,0.1ONa N3的25mmol/L pH 7.4 PBS中,4℃保存。 三、IRMA检测法反应模式 (一)双标记FITC 抗FITC 法 将两株McAb分别标记FITC和I,按经优化的比例混合稀释液作为标记试剂。检测时,将样品和标记试剂各100ttL加至12×75mm管中,充分混合,放37℃水浴中30~60min,生成夹心免疫复合物。加入抗FITC磁性微粒子悬浮液100tLL,室温反应5min,置磁性分离器上。倾去管中上清液,用PBS—T洗液0.5mL洗两次,在自动r计数器上按双对数或四参数方程处理测量数据,即可打印出相关参数和待测样品浓度。 (二)双标记BAS法 该法是将两株McAb分别标记生物素和I作为标记试剂,以磁性微粒子固相为分离试剂。其余同上法。 (三)磁性固相一抗法 此模式和常规IRMA的实验原理相同,将两株McAb分别标记I和制备磁性微粒子固相。检测时,取待测样品、I—McAb和磁性微粒子McAb悬浮液各100/1L于管中混匀,37℃温育后,即可在磁性分离器进行洗涤分离,去除游离I-McAb,操作虽简便,但主要缺点是每一检测项目要单独制备磁性微粒子固相抗体,既繁琐又不经济。 四、竞争法反应模式 (一)磁性固相一抗法 取一抗(PcAb)纯化,制成一抗磁性微粒子固相。检测时取待测样品和I标记抗原各50微升,磁性微粒子固相一抗悬浮液100微升加至12×75mm管中,充分混匀,置37℃温育3O~60min,在磁性分离器上倾去上清和洗涤2~3次。在自动r计数仪上测放射性强度,按Logit对log数据方程处理测量数据,即可得出有关参数和待测样品浓度。此模式因待测物的不同,要单独制备对应的磁性微粒子固相抗体。 (二)磁性固相二抗法 取样品、I标记抗原和抗体各50微升加至12×75mm管中,混合后置37℃ 温育30~60min,加入磁性固相二抗悬浮液100微升作为分离剂,混匀后室温反应5min,以下操作程序洗涤和测量同(一)法。 (三)抗FITC磁性固相二抗法 将第一抗体IgG标记FITC,用抗FITC磁性固相作为分离剂,最大优点是抗FITC二抗可以共用。检测时将待测样品、I标记抗原和FITC标记抗体各50微升加至管中,37℃温育3O~60min,加入抗FITC磁性固相悬浮液100微升,室温反应5min,以下洗涤和测量同(一)法。 (四)亲和素磁性固相法 此模式用BAS作为分离系统的共用试剂,第一抗体IgG 标记生物素。检测时,将待测样品、I标记抗原和生物素标记抗体各50微升加至管中,37℃ 温育后,加入BSA磁性微粒子悬浮液100微升,余法同(一)法。 五、第五代放免分析技术特征 (一)第五代方法 和第四代方法比,第五代方法是在第四代RIA技术的基础上,引入当代纳米磁性微粒子制成固相二抗分离剂,完全克服传统包被固相物理吸附方法制备固相抗体的不均一性,简化了操作程序,缩短了出报告的时间,主要技术参数比较如表1。
(二)磁性一抗和磁性二抗方法 比较根据反应原理可设计磁性固相二抗作为分离剂,或制备磁性固相一抗作反应试剂。两种方法比较见表2。
(三)三种分离剂比较 磁性固相分离剂可分为二抗、抗FITC二抗和BAS三种类型,其作用原理和性能不同见表3。
六、结束语 早在2O世纪8O年代有作者报道在RIA技术中采用磁性微球作为固相载体的方法学研究,提出了以共价键结合制备固相抗体的新颖性方法,而深受关注]。因受当时技术条件所限,国内外许多作者的实验结果表明,制备的磁性微球粒径过大,均一性差,在免疫反应液中悬浮时甚短,达不到检测技术所要求的条件。随着材料工艺制备技术的进步,至2O世纪9O年代中期纳米磁性微粒子研制取得成功,首先在化学发光免疫分析(CLIA)试剂中推广应用。 近年来,国外有磁性分离剂的RIA试剂盒进入国内市场,有关试剂制备技术和方法研究至今未见报道。作者根据国外磁性微粒子RIA试剂盒的实验原理,结合标记物制备的有关资料,开展了有关试剂制备技术和方法实验研究。 从现有的对比分析结果可以看出,本法目前应用最多的塑料管或塑料珠固相RIA相比较,主要具有以下优点: (1)双标记IRMA设计新颖,两种标记抗体在液相中生成夹心免疫复合物,反应时间较短,连有抗FITC抗体的磁性微粒子作为固相分离剂,简便快速,可降低第一抗体的用量; (2)经偶联剂将抗体IgG与磁性微粒子共价键结合,牢固性好,均一性高,连接蛋白质的量可以自行控制; (3)连有抗FITC抗体的磁性微粒子作为固相分离剂可以通用,根据不同检测项目可以调整分离剂的用量,适合大量工业化生产; (4)采用双标记IRMA检测生物活性肽类,不但简便快速,而且进一步提高了肽类检测的特异性和灵敏度。 Yallow和Berson创建RIA技术45年以来,在相同基本理论上派生出多种非放射性标记免疫分析,目前两类检测试剂盒在市场竞争中并存。由于RIA试剂有效期短,操作程序多,检出时间长,需要一定的辐射防护而处于弱势。第五代RIA技术的研发成功和应用,最大限度地简化了操作程序,缩短了检测时间,并为实现完全自动化分析创造了条件。从而提高了竞争力。展望前景,第五代RIA技术在科研机构,高等院校和中小医院临床检测仍有相当大的发展空间。 参考文献 (1)沉关心,周汝麟。现代免疫学实验技术[M]。武汉:湖北科学技术出版社.1998,94—142。 (2)唐宝军,徐文.磁性微粒子在放射免疫诊断试剂中的应用[J]标记免疫分析与临床,2004,11(1):53-54。 (3)李振甲。放射免疫分析技术研究现状与前景[J]。标记免疫分析与临床,2000,7:156—160。 (4)唐宝军,李振甲。磁性微粒的制备方法及其在免疫分析中的应用[J]。国外医学:临床生物化学与检验学分册,2004,25(增刊):1—3。 (5)A L—shawi I A.A two-site immunoradiometric assay with magnetizable particles human liver ferrtin as a model[J] .ClinChem ,1984,30:38—42. (6)Sieben S,Bergemann C,Lubbe A,et a1.Comparison of different particles and methods for magnetic isolation of circulating tumor cells[J].J Magnetism and Magnetic Materials,200 1,225:175—179. (7)李振甲。国内外标记免疫分析技术研究现状[J]。中华检验医学杂志,1999,23:278—280。 |
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