生命经纬网友lidm的问题为：

我要分析骨髓间充质干细胞的表面抗原，以分析我提纯的细胞是否有许多造血干细胞和成纤维细胞。请赐教！

生命经纬网友schoman的回答为：

骨髓间质干细胞的检测并不难，只要有荧光标记得抗体，操作非常容易，但是，对于骨髓间质干细胞的特异性标记我并不熟悉，请查找专业的文献，然后，按生产公司定购产品即可。

生命经纬网友doctormeng的问题为：

流式与westen在检测蛋白表达方面各有什么优缺点？

流式可以检测在胞浆中表达的蛋白吗？敏感性怎么样？

操作上有什么特殊要求？

生命经纬网友schoman的回答为：

流式细胞仪当然可以检测细胞内蛋白，这一点，并不是很难，当然要比检测细胞表面抗原复杂些，好在都已经有现成的方法，不成问题。

不过流式的应用原理主要还是抗原和抗体反应和western、免疫组化没有本质差别，但是由于免疫组化和western都有酶催化底物的放大体系，因此，流式不适合检测低表达的蛋白，低表达的还是采用western（尤其是化学发光底物更佳）和免疫组化更好。当然，流式最大的一个特点就是，可以定量（百分比），如果是高表达的用流式细胞仪非常有优势。

流式检测时要求有抗体，可以是直接标记或简介标记的荧光抗体。细胞需要预先固定处理，常用的是多聚甲醛、TritoonX－100、75％乙醇等，具体步骤可参考相关文献，都有详细说明。

荧光抗体标记的选择指南：

对于流式检测最初的一步就是选择何种方法，通常是何种荧光物质标记的抗体。厂家根据需要开发了各种荧光标记的抗体，进行选择时首先要满足的就是所选择的抗体必须在流式上能够检测，各单位买的流式仪功能不完全一致，首先要和检测方进行联系，看能否检测。在附表里我将常用的荧光标记物质的激发波长和检测波长给出，可以参考。有几个原则一起说一下：

1、流式检测时首推荧光物质直接标记的抗体，如果没有直接标记的抗体，用间接发，即二抗上标记荧光分子同样可以。不过这增加了处理的难度，处理步骤增多，往往会不同程度影响检测结果。

2、厂家推出的抗体有一些明确写明适合流式检测，而另一些则表明适合免疫组化、western等，首选前者，可以保质保量，但是后者并不是不可以用，一般来说如果没有明确的表明适合流式检测的抗体，采用后者也是可以的，不过要注意其检测结果不一定非常理想。

3、单抗和多抗均可应用。

4、绿色荧光蛋白等本身有荧光的物质在检测时会占据一个荧光通道，我也曾碰到几次有人将转了绿色荧光蛋白的细胞再采用FITC标记的抗体来检测目的蛋白（据说还有人用此方法得出了满意的结果！），岂不知绿色荧光蛋白和FITC是一个荧光通道，更本不能一起检测。

5、如果是检测淋巴细胞这类细胞，经常用到多种抗体同时标记，选择时切勿选错。我自己比较倾向于多重标记，因为这样可以减少抗体和细胞用量，特别是对于小鼠的血标本，经常采到的血量微少，采用多重标记更有利。当然这要求流式操作者有较高的水平，注意调节流式仪的各种参数。

生命经纬网友zzy8896的问题为：

1、绿色荧光蛋白在转质粒后在细胞可以发光多久？

2、我打算做双标，那么两种一抗应如何加，是同时加还是做完一种以后再加另一种？

3、我要用转了绿色荧光蛋白的细胞来做另一种荧光检测，目的是进行两种荧光同时检测，会不会影响绿色荧光蛋白的检测，最好应如何处理，采用哪一种荧光抗体最好？我的检测对象为包浆蛋白？谢谢！

生命经纬网友schoman的回答为：

1、绿色荧光蛋白GFP只要蛋白不降解,荧光不会萃灭.若做稳定表达,那就可以随时观察荧光,但做稳定表达时程很长;若做瞬时表达,在转染后48小时左右应该就有GFP表达,可以观察荧光.

2、做荧光双标,一抗可以同时加,二抗也同时加.但是,两个一抗要不同种属来源,两个二抗用不同的荧光标记.比如说,第一个一抗为鼠抗A(单抗),第二个一抗为兔抗B;第一个二抗为抗鼠IgG(cy2标记,绿色荧光),第二个二抗为抗兔IgG(cy3标记,红色荧光).在荧光显微镜下观察时,可以在同一个视野分两次激发观察,并分别照相,再将两次照相叠加.这样可以在同一个细胞内,观察抗原A和抗原B的亚细胞定位.

3、用转了绿色荧光蛋白的细胞来做另一种荧光检测,不会有什么问题.最好用cy3标记的二抗去染另一种蛋白.因为绿色和红色的差别很分明,二者叠加又是黄色的信号.

我说的cy2标记的抗鼠IgG和cy3标记的抗兔IgG在KPL公司有买。

生命经纬网友verygood的问题为：

如何以流式细胞仪检测细胞核内蛋白。上次问过BD公司的工程师，说需要将核膜打孔，不知有没有人做过？具体方法如何？效果怎样？

另外以流式细胞术怎样测定进行所需检测物质的定量研究？（不是做细胞亚群分析）

生命经纬网友schoman的回答为：

流式仪检测细胞核内蛋白我也没有检测过，但是应该是按照BD工程师所说进行固定穿孔，这种检测和细胞内蛋白的检测方法差别不大，应该是有现成的方法可以参考。

进行检测物质的定量最简单的方法就是统计检测蛋白的平均荧光强度。常用的流式检测统计方法：一个是阳性率，另外一个就是平均荧光强度，平均荧光强度是一种观测蛋白表达相对定量的简单常用方法。细胞表面表达的蛋白越多，其结合的荧光标记抗体越多，因此其平均荧光强度就越高。进行这种方法检测要求每次流式检测的机器条件要完全一致，并且整个试验过程不能拖得太长，因为随着时间的推移，即使前后使用的仪器条件完全一致，但是机器本身的效能也会改变。我曾经观察过，仪器经过半年时间其效能就要发生明显得改变，需要进行光路的调整。因此，最好整个试验过程不要超过半年，否则前后的可比性就较差了。

生命经纬网友liy506的回答为：

如果你检测的是胞内分泌性蛋白（如细胞因子），应在细胞培养过程中加入莫能霉素，以阻断细胞因子的分泌；收获细胞后以4％多聚甲醛固定20min，加入0.1Triton X-100破膜10min，以后步骤与检测膜表面分子相同。也可采用皂素进行破膜。

关于流式细胞检测后的统计学处理

常常有人在检测完细胞后问我如何进行结果的问题。

常见的检测结果如有明确的分组和例数，例如有人检测患者在治疗前后淋巴细胞免疫分类的变化，如果各检测了50例，可以按照常规的统计学方法，如采用配对T检验进行统计处理。

常常见到的是另外一种情形，如有人检测一种药物或者转基因后对细胞周期的影响，或者某种物质对细胞一种蛋白表达的影响。像这一类实验，常常仅仅有实验细胞和对照细胞，在得出结果后，有人喜欢进行统计学处理，还有人不进行统计学处理，仅给出典型的流式检测图进行描述。两者都可以，但是要求是必需重复实验三次以上，否则，不可能进行统计学处理。对于后者，尽管不进行统计学处理。但是必需说明，重复多少次，结果基本一致。

生命经纬网友lemontree的问题为：

我近期也要做流式细胞仪，但是同实验室没有人做过，所以这方面的经验比较少，看了这里发的帖子以后明白了许多，请问细胞固定后怎么保存呢？可以保存多少天呢？因为做time course的时候不能同时收集那么多的samples，而且要排队才能做上。

生命经纬网友schoman的回答为：

一般来讲，实验是观察不同时间点对细胞的影响，我的建议是先作时间最长的点，依次递减。譬如：观察药物作用12h、8h、4h、2h对靶细胞的影响。可以同时培养细胞，12h的药物先加入培养细胞中，过4个小时后，加入药物预定观察8h的细胞，再过4h加入到预定观察4h的细胞中，再过2小时，加入药物到2h组。这样，可以同时收集各个时间点的细胞，同时处理上机检测，避免了细胞固定或者多次检测 的麻烦。

一般来讲，固定的细胞或多或少对检测有一定影响，我比较推崇采用新鲜细胞进行检测。所以我建议还是采用上述方法，同时检测，这样的结果会更好。

生命经纬网友而今的问题为：

1、洗涤时用全血还是静置后上清？如果后者，与富血小板血浆法有何区别？

2、CD42b阳性率不高，它可否作为血小板设门的抗体？我知道常用的有CD41和CD61。

3、先标记后固定的标本可保留几天检测？

生命经纬网友schoman的回答为：

流式细胞仪设门区分血小板最简单的方法是采用FSC和SSC，当然采用CD42、41、61都可以，但是如果为了设门还要再买一个抗体似乎并不合算，而且多个抗体同时加入增加了检测的难度。一般来讲采用采用FSC和SSC来区分血小板是能满足需要的，当然采用抗体标记更准确。由于采用FSC和SSC设门可以有效的区分血小板和红细胞，所以采用全血或者分离富集血小板并没有太大差异。

另外，在加入抗体后最好用PBS洗涤一次，这样可以去除非特异性结合。

我没有对固定的血小板进行保留天数的观察，原则上还是新鲜标本，早做早好，一般来讲固定72h还是效果不错的。你可以在检测时比较一下，如果新鲜标本和固定72h或者更长时间没有明显差异就可以。

血小板活化受多种因素影响，一般在抽血后血小板一旦暴露到空气中即会活化，所以，我提醒你在抽血后尽早处理标本，否则抽血后到处理的时间长短很可能影响实验结果。具体事项可以参考相关文献。

生命经纬网友sbboy1973的问题为：

我想把血管外膜上的神经细胞在荧光标记后用流式细胞仪单独分选出来，然后再用Westen immunoblotting方法测定蛋白含量（因为这种蛋白平滑肌细胞也有），这种方法是否可行？

生命经纬网友schoman的回答为：

理论上没有问题。但是有几点必须要注意：

1、要将血管外膜作成单个细胞，因为流式细胞仪检测的是细胞。

2、必须找到血管外膜细胞和平滑肌细胞的理想区分标记：抗体，这种抗体必须是血管外膜特异的。

3、流式细胞仪的分选成本较高。

4、流式细胞仪的分选纯度在95%左右，是不是少量混入的细胞（低于5%）会对检测有影响。

生命经纬网友coldant的问题为：

流式细胞术能否检测结肠标本？我想测结肠肌间丛cajal间质细胞凋亡以及stem cell factor（SCF)含量。

生命经纬网友schoman的回答为：

流式细胞术检测细胞是比较好的，组织必须进行酶消化等处理，使其成为单细胞，因此不论是何种组织作流式检测都存在这个问题，操作起来比较麻烦。另外，冻存的组织解冻后细胞很容易破碎，一般不再适宜进行流式检测。

结肠肌间丛cajal间质细胞位于结肠组织内，含量少，很难将其与其他细胞区分开来，因此单纯检测这种细胞比较困难。如果

凋亡检测可能不是很难，采用Tunel方法可以检测（免疫组化，有试剂盒），最关键的还是如何区分是结肠肌间丛cajal间质细胞的凋亡，还是其它细胞的凋亡。

stem cell factor（SCF)含量很少，检测比较困难，没有经验，觉得采用免疫组化可以试一下，或者干脆组织匀浆后进行Elisa检测。

生命经纬网友flyheck的问题为：

以前没接触过流式，有谁做过用流式细胞仪检测小鼠T细胞Fas、caspase8、3的吗？

生命经纬网友schoman的回答为：

Fas和FASL位于细胞表面，采用FITC 等荧光素直接标记的抗体检测非常容易。可以直接向代理商 订购抗体。

CAspase 8和3位于细胞内，细胞需要进行固定穿孔，常用的固定穿孔剂有Pharmingen公司和Caltech公司的产品，国内分别是基因公司和联科公司代理。可以向他们订购。Pharmingen公司还提供caspase的整套流式检测试剂盒，检测效果要好于自己建立的方法，推荐采用整套试剂盒。

对于单参数的检测一般采用直方图而不是散点图，分析其阳性率和平均荧光强度。

生命经纬网友fly_slient的问题为：

目前我打算做有关血小板活化的课题.打算买CD62P-FITC请问是否可行.

1、实验用的鞘液是否需要购买?

2、如果我要用FITC,是否需要先打听学校的仪器支持这种标记否?

3、有文献说最后要调节细胞浓度为1×10的7次方,如何调节?

生命经纬网友schoman的回答为：

1、买CD62P-FITC应该可行。

2、实验用的鞘液无需购买，用蒸馏水替代没问题。

3、没听说流式不能检测FITC的，检测应该没问题。

4、加入的抗体标记的细胞（指血小板）不能超过10的7次方。这个简单，用血球计数仪技术一下即可。我推荐你每个检测用的量不要超过10UL，应该可以。

5、我最近的总结发现，检测血小板受的干扰很大，最重要的问题是如何设门区分血小板，因为血小板小，和杂质分部开，这个问题最好的解决办法是另外加入一个血小板标记抗体，如：CD41或者CD61。采用双标记法，即另外加入一个CD41的抗体，如：PE标记的CD41。

6、另外血小板活化检测受很多影响，要求实验条件尽量一致，请参考我在流式区的帖子。

生命经纬网友fly_slient的问题为：

我想一次上机操作多收集些病人血样,所以想存放一下标本.您看应该采取下列哪个方案

1、全血--固定--4℃存放多长时间--加抗体

2、全血--固定--加抗体--4℃存放多长时间(4℃温度是否合适?)或请您推荐一种方法。

生命经纬网友sumhao的问题为：

我们现在的流式也是BD公司的，现在想装一个筛选的装置，请你提供一些信息，好吗？Thank you very much !!!

还有一个问题，一般染表面的抗原，可以用所用抗体的同型抗体作为对照，而不需要固定，是不是这样？作双染时，对照的设定应该如何考虑？

生命经纬网友schoman的回答为：

如果是FACSCalibur这种型号的流式仪分选效果并不理想，主要是分选速度慢。具体可以联系BD的工程师。

同型抗体作对照是设阴性阳性的界限用的，细胞表面染色一般的是不需要固定的，但是一些表达变化很快的分子，如血小板活化后的蛋白通常会随时间有变化，所以最好是先固定后，再抗体标记。另外，如果抗体标记后不能当天检测，最好也固定，一般可以放置1-4天，基本检测结果不受影响。常用的固定液是2%的多聚甲醛。

双染时要分别加入同型的抗体对照。双染是最重要的是进行仪器的补偿调节，所以除了同型对照的抗体，还要采用单标记的两管进行仪器的补偿调节。

生命经纬网友sumhao的问题为：

我对于流式双染仍然不是很清楚。对照的设立应该是如下（举例）：1.cell only；2.PE-同型抗体1；3.FITC-同型抗体2；4.PE-抗体；5.FITC-抗体2；6.双染样品

但是，到上样具体操作时，我就不是很清楚，应该如何作啊？

生命经纬网友schoman的回答为：

先用这三管（1cell only 2.PE-同型抗体1 3.FITC-同型抗体2）调节FL1和FL2的电压，以细胞的位置低于10E1位置较合适。

用FITC-抗体2调节FL2－FL1的补偿。

用PE-抗体1调节FL1－FL2的补偿。

最后用双染的样品进行验证补偿的正确与否。

生命经纬网友greenhand的问题为：

首先，鞘液，自配的PBS溶液经0.22um膜过滤处理后可否替代BD的成品。

PI 溶液，自配的效果应该可以吧？

关于样品的处理，为了防止粘连细胞干扰结果以及阻塞进样针，是否需要用膜过滤，膜的孔径是多少比较好呢？

最后，关于机器的维护，清洗液：次氯酸钠溶液的浓度是多少呢？

又各种相关的溶液都需要过0.22um的膜吗？那清洗液呢？

市售的次氯酸钠原液杂质好像很多，该如何处理呢？

生命经纬网友schoman的回答为：

如果按照标准的要求你所提到的事情可都要照办。

1、鞘液，自配的PBS溶液经0.22um膜过滤处理可以替代BD的成品，让BD的东西见鬼去吧，不就是个PBS还要收我们这么多钱，老美可真有钱。

2、PI 溶液，自配的效果可以替代BD产品。

3、如果是细胞粘连很多，可以用滤膜过滤，细胞的大小为数十um，只要孔径比细胞略大让细胞通过就可以了。

4、次氯酸钠用10%就可以。市售的次氯酸钠原液杂质多，可以稀释后过滤去除杂质，或者更换好的试剂。

但事实上，我们没有严格按照BD 的要求进行。

鞘液我都是用的3蒸水替代。实验是没有问题的（分选除外）。

作PI染色检测细胞周期，我过滤过几次，但是后来嫌繁，就再也没有过滤过。到现在没有堵住过机器，我的经验是有时会有大的细胞团会堵住机器，马上用Prime进行反冲，可以将细胞团块反冲回来，然后继续检测。