摘 要： 目的：探讨细胞内病毒抗原的超微定位的方法。方法：采用包埋前免疫胶体金方法标记I型单纯疱疹病毒(HSV-1)抗原以研究该病毒在人胚肺细胞(HEL)内的超微定位。结果：发现金颗粒约为5 nm，大小均一，在HSV-1囊膜、内质网膜表面及其邻近区域有大量的金颗粒，而阴性对照在这些地方未见金颗粒。结论：表明包埋前免疫胶体金方法可靠，可用于病毒抗原的超微定位研究。

关键词：包埋前免疫胶体金技术；免疫电镜；I型单纯疱疹病毒；病毒抗原

中国图书分类号 R392-33 The application of preembed allowfullscreen='true'ding direct immunogold for ultrastructual localization of intracellular antigens of HSV-1

细胞内病毒抗原的定位及检测，不仅可用于病毒鉴定，而且是研究病毒形态发生及病毒致病机理的重要手段，细胞内病毒抗原的定位以往多用免疫荧光法(IF)和过氧化物-抗过氧化物酶法(PAP)。前者不能用于细胞内抗原的超微定位；后者虽能，但由于有显色剂电子密度低在电镜下阳性显色不易与正常细胞结构区别等缺点。为克服上述方法的不足，我们建立了包埋前免疫胶体金直接法标记细胞内病毒抗原方法，且成功地应用于研究I型单纯疱疹病毒抗原的超微定位。

一、材料与方法

1、细胞与病毒

（1）人胚肺细胞(HEL) 人胚肺取自人工引产4个月胚胎，按常规制备传代HEL细胞。

（2）I型单纯疱疹病毒SM44株(HSV-1 SM44) 由美国耶鲁大学医学院熊菊贞教授惠赠。

2、氯化金(HAuCl4) 上海试剂一厂产品，批号XK13-0010801064.

3、葡萄球菌A蛋白(SPA) 西德Boehringer公司，Cot NO.775177.

4、血清 从武汉市七医院产妇血清中筛选出HSV-1阴性血清和HSV-1阳性血清，其免疫荧光效价为1：640.

5、5 nm胶体金制备 按Romano方法制备［1］。

6、SPA胶体金复合物的制备、纯化和质量鉴定

（1）SPA与胶体金结合的最适浓度测定 取50 μl SPA(1 mg/0.2 ml)加入硅化的1.5 ml Ep管中用0.005 mol/L NaCl进行倍比稀释，各管加入250 μl胶体金液(pH 6)混匀后再加入250 μl 10% NaCl，用胶体金颜色由红变蓝的EP管的SPA量，计算出稳定1 ml 5 nm胶体需SPA 6 μg.

（2）SPA胶体金复合物的纯化及鉴定 按上述最适浓度将SPA与胶体金混合，加入1%聚乙二醇2000(PEG-2000)使其最终浓度为0.05%，60 000 r/min, 4℃，离心1 h，于透射电镜下摄片鉴定其大小均一性。

7、包埋前胶体金标记细胞内抗原的电镜观察 HSV-1 SM44感染HEL细胞12 h，细胞病变至++，用PBS洗3次，橡皮帚刮下细胞，1 500 r/min，离心10 min，细胞沉淀悬浮于0.5 ml 1%多聚甲醛、0.002%皂素、0.025%戊二醛混合液中，4℃ 1 h，PBS洗3次，加1：40稀释的HSV-1阳性血清。室温1 h，PBS洗3次，加1：80稀释的SPA胶体金复合物，室温 1 h，PBS洗3次后，常规锇酸固定、乙醇脱水、包埋、切片用于透射电镜观察，用阴性血清代替阳性血清作阴性对照。

二、结果

1、SPA胶体金均一性及大小鉴定 在电镜下见SPA胶体金呈圆形，单个分散，电子密度高、致密。金颗粒大小基本一致，其直径平均为(5.04±1.14) nm(图1)。

2、SPA胶体金直接法标记HSV-1电镜观察 电镜下见HEL细胞膜结构完整，细胞浆中病毒囊膜及其邻近的内质网膜上的病毒抗原结合，在未成熟的病毒囊膜上也有大量的金颗粒，他们的外周区域可见大量的金颗粒聚集(图2)。阴性对照电镜下可见细胞膜结构完整，细胞核内有大量未成熟的HSV-1颗粒。细胞浆内有大量成熟的病毒颗粒，但其囊膜上无特异性结合的金颗粒。少量金颗粒透入细胞浆及细胞核内呈随机散在游离性分布(图3)。

图1 5 nm SPA胶体金电镜观察Fig.1 Electronic microscopy of 5 nm SPA-immunogold

图2 SPA胶体金标记HSV-1抗原免疫电镜 Fig.2 The immunoelectronic microscopy of SPA-gold labelled HSV-1 antigens

Note:a. the SPA-gold particles conjugatied with the envelope of mature HSV-1；b. the SPA-gold particles conjugated with the envelope of immature HSV-1;c. the SPA-gold particles existed in the membrance of endoplasmic reticulum;d. the areas congregated with SPA-gold particles

图3 阴性对照免疫电镜 Fig.3 The immunoelectronic microscopy of negative control Note:a.immature HSV-1 in nucleus b.mature HSV-1 in cytoplasm c.the scattering free gold particles

作者单位：湖北医科大学病毒所临床病毒室，武汉 430071