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噬菌体多肽展示文库及其新药研究中的应用

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一、概况

噬菌体展示技术(Phage Display Technology)在80年代中期产生, Smith G第一次描述了在丝状噬菌体表面展示外源多肽片段的原理。该办法主要是用DNA重组技术将大量的多肽编码顺序导人噬菌体的衣壳蛋白基因中,从而使表达出的各种多防以与PIII或PVIII蛋白融合的形式出现在噬菌体的表面,即首先构建噬菌体多肽展示文库。10多年来在构建噬菌体展示多肽文库方面以及用生物学方法-biopanning从该文库中筛选出与已知靶物质相结合的多防编码顺序方面取得了巨大的进展。近年来,在识别蛋白或受体的小肽顺序的鉴定上、在结构和功能上模拟已知蛋白的多肽模拟物的研究上、在筛选鉴定能与人类病毒、细胞、组织及肿瘤等生物靶系统结合的多肽研究日益增加。噬菌体多肽展示库提供了这样的可能胜:可从多肽展示库中分离出一个能与重要蛋白如与炎症有关的抗体、与介导细胞粘着的整合蛋白等特异性结合已具有相应生物活性的多肽。特别是有可能发现一些多助配基而导致多肽模拟药物(peptidomimetic drugs)的产生。噬菌体及库有广泛的应用,它不仅可以展示小肽,而且可以展示较大的蛋白,如单链抗体。

丝状噬菌体是在菌毛阳性的细菌中繁殖的,它不造成细菌的裂解,而可使细菌分泌出多拷贝的,在其表面展示出插入顺序的噬菌体。结合到一个靶分子上的噬菌体可以被洗脱下来,然后又在细菌中生长扩增。这就是所谓生物锅(biopanning),重复多次就可以富集结合到靶分子上的有关噬菌体。有关结合性多肽顺序可以通过编码该多肽的噬菌体基因组部分的核苷酸顺序的测定完成。最后插入的多肽顺序可以用重组技术或人工合成的方法再造,通过这种方法可以发现目标受体的特异的和选择性的配基。

在展示文库中,多防顺序被融合在最小的衣壳蛋白III的氨基端内或其附近。另一个较小程度被应用的融合对象是大的衣壳蛋白VIII。应用pIII的好处是相当大的多肽或蛋白的插入并不导致噬菌体感染力的丢失。在每一个噬菌体颗粒上只有大约5个拷贝的pIII被锚定在噬菌体的顶端。如应用FUSE 5载体时每个pIII上都有一个插入顺序,因此是一个多肽的多价显示。过去数年来的报道表明,在体内和体外应用这个载体发现的不同靶分子的多肽配基时,多价显示并不是一个必要的条件。

噬菌体颗粒令人惊异地能耐受苛刻的环境条件,如在pH 2.2和4-6M。

尿素的条件下而不丧失感染细菌的能力,这种特点被用来解聚靶分子和噬菌体的结合。需要注意的是结合在靶上的噬菌体并不必非从64孔板或组织上洗脱下来,通常可直接将细菌加入到64孔板或匀浆的组织中,铺极后即可获得有关噬菌体。如果受体、配基作用的生物化学的细节已知的话,更特殊的一些方法也可用于洗脱。如含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)的多肽和阳离子螫合剂如 EDTA则以使结合到 α5β1上的噬菌体解离。

二、识别短肽顺序的蛋白和受体

一旦某个蛋白可以获得纯化或者转染后在细胞表面表达该蛋白,那么多肽文库就提供出一种可能性,去定性特异性结合到那个蛋白上的配基。在活细胞中蛋白一蛋白间的反应常常由相当大的表面积外导,但也有的只与一小段肽的结合有关。   噬菌体展示多肽文库特别适宜研究队指导下的分子间反应。噬菌体多肽展示文库最重要的应用就是确定抗体的抗原决定簇。抗体能识别小肽通常仅基于3-4个保守的氨基酸。噬菌体展示揭示出的多肽,描绘出被抗体识别的蛋白区是可能的。牵涉到自动免疫失常的抗体的决定簇的确定可能对疾病的免疫机制给予重要的信息。

噬菌体展示的一个多肽也可以反向应用去产生一个抗展示的多肽的抗体。丝状噬菌体是一个非常强的免疫原,由它可以分离出一个特殊的噬菌体展示的多肽的抗体。

在免疫系统中存在着一些可以识别小肽的分子。主要的组织相容性分子(MHC)的功能就是识别在宿主的细胞表面上的来源于内源和外源的蛋白。当一个细胞变得不正常,或者被有害的微生物侵入宿主时,基于结会到MHC分子的多肽顺序,免疫系统可以识别。噬菌体展示文库一直被用来描述每一种MHC分子所识别的多肽结构。

细胞表面整合蛋白家族可以识别三防RGD。这些整台蛋白介导细胞粘附多种含有RGD的细胞外的基质蛋白,例如纤维粘连蛋白,vitronectin和fibyiflogen。筛选噬菌体展示库已经证明整合蛋白α5β1、αLib、β3、αvβ3、αvβ5当中每一种都有略微不同的肽段的特异结合性,而且乐于结合独特的环状二硫键顺序中的RGD的多肽。这反映出每一种整合蛋白对不同胞外蛋白的不同的嗜好性。已发现筛选出的结合。α5β1的多肽含CRGDGWC顺序,而对αvβ5的结合多肽有更为复杂的结构CDCRGDCFC(又称RGD-4C),这个整合蛋白结合多肽含有4个半脱氨酸,这些半眈氨酸的配对可形成不同二硫键的混合物。由半胱氨酸随机氧化而合成制备的双环多肽的活性足以导致细胞的粘连,后来的实验又证明另一种二流键的排列能给出更具活性的多肽。

用噬菌体展示多肽常常揭示出新的不曾料到的多肽配基。用α5β1整合蛋白可筛选出一个环形的多肽CRRETAWAC,它反过来又是这种整合蛋白特异的配基,而不与整合蛋白家族的其他成员结合。这个多肽能防止α5β1介导的细胞对纤维粘连蛋白的粘连。另外一种整合蛋白结合的是NGR,几乎是RGD的反向顺序。NGR顺序出现在许多蛋白的顺序中,如纤维粘连蛋白,但它对整合蛋白只有相当低的亲和力。NGR在墓质蛋白和整合蛋白反应中的作用还不清楚。

噬菌体展示文库也常用来选择并不识别RGD或NGR,但能识别其它基质蛋白的整合蛋白的配基,如α6β1,(一种膜层蛋白)和αMβ2(一种免疫球蛋白样的粘和蛋白的白细胞受体)。

能以两种假性对称方式I和II之一种结合Src同源区III(SH3)的配基也用噬菌体展示研究过。SH3存在于许多蛋白激酶中,并结合信号分子的脯氨酸富集区。I型的保守顺序是RPLLPPLP,而II型是反方向肋APPLPPR。蛋白中出现的脯氨酸富集区与激酶反应,卷入了信号传导。多肽文库也用来发现另一个蛋白激酶和信号传导蛋白的共同区SHZ的配基。SHZ区识别一个含有磷酸化的酪氨酸的多肽。

三、新的肽模拟物和最小化蛋白

抗体并不总是对应于一个蛋白中的线性氨基酸顺序,而是能识别一个间断的决定簇&0;&0;折叠的蛋白的特殊的构型。用某种抗体去筛选一个噬菌体文库,产生的多肽将模拟折叠蛋白的结构。这些配基被称为模拟簇(mimotopes)。展示环形多肽的文库适宜分离出模拟簇,依赖于环形结构的活性多肽的已被分离出,如果半胱氨酸被阻扼,多肽就失活,因为它将不能折叠成合适的构型。除了抗体,还有与几种蛋白反应的分子的模拟簇或结构模拟物已被噬菌体展示所发现(见表2,略)。

一个能展示出适当构型的小肽,可以替代天然蛋白的功能。随机噬菌体展示多防文库,结合一些其他方法可以提供非常好的程序去研究蛋白的有效的模拟物以及有活性的最小的肽段顺序,如多肽激素EPO和TPO的模拟多肽对人类疾病有很好的治疗作用,14个氨基酸的环形的TPO模拟多肽的二聚体有着332个氨基酸TPO的活性,而仅13个氨基酸构成的模拟配基可模拟162个氨基酸组成的EPO的性质。

四、结合到复杂的生物系统的多肽的选择

近年来噬菌体多肽文库在选择可结合到更为复杂的靶目标的多肽上非常有用。这些靶目标是人类病毒,活细胞,鼠组织和肿瘤等(见表3,略)当应用这些复杂的靶系统时,有指导的噬菌体筛选程序是必要的,促进特殊的多肽介导的结合远高于本底性的噬菌体的附着。首次应用的例子是用被尿激酶受体转染后的细胞分离这个受体的多肽配基。通过应用两个不同种的感染尿激酶受体后的细胞,如一个鼠和一个昆虫的细胞系,然后去筛选多肽配基。此时两个细胞间仅有尿激酶受体是共同点,分离出的多肽的motif并不与已知结合到受体上的尿激酶相似。基于细胞表面表达并源受体的这种筛选系统也被用来筛选黑色素受体的配基。

另外一种洗脱特异结合的噬菌体的方法是用能干扰相互反应的试剂来进行,如抗体和多肽。人的血小板作为靶物质已用来筛选凝血酶受体的多肽配基,结合到血小板上的噬菌体是用已知的一个多肽配基洗脱的。

抗体洗脱一直被用来确定人腺病毒不同衣壳蛋白的结合多肽。与病毒反应的多肽的定性就会给与病毒结合的蛋白及分布于细胞表面病毒的潜在受体等提供线索。如分离的一些多肽顺序与已知的腺病毒受体的相似,其中的一个是整和蛋白。结合病毒的多肽的应用将干扰病毒的感染和防范病毒的结合和内在化。那样的多肽CLRSGRC是由展示文库用相应病毒筛选出来的。环型的多防可以部分地防止病毒对人类细胞的感染,值得注意的是纯化的展示结合病毒多肽的噬菌体颗粒也能防止病毒的感染。

多肽可以结合到细胞的表面,如果靶受体是未知的,那么识别特殊细胞的多肽也能被分离出。

更为复杂的是体内筛选,当静脉注射噬菌体库后,可以发现定位在鼠的一个器官的多防顺序。噬菌体内循环几分钟,然后用磷酸盐灌注,可以获得内皮为靶的噬菌体(如表3)。最近有关定位在肺的多肽的受体已被鉴定。定位肿瘤血管细胞的多肽的发现,将有益肿瘤抑制的研究。

五、由文库衍生的多肽的应用

如抗肿瘤侵袭的高亲和力尿激酶受体拮抗物的筛选,睫状神经生长因子(CNTF)多助展示文库的构建,TGF-a展示文库的构建及与EGFR高亲和力结合多肽的鉴定、特别是具有相应天然物活性的、均为环型的13、14肽的EPO、TPO模拟多肽的成功发现为新药的研制开辟了一条崭新的道路。特别应当指出的是用培养的细胞筛选展示库的方法已成功筛选出黑色素受体-1配基的模拟多肽。国内北京大学,军事医学科学院,吉林大学等均有应用噬菌体展示文库的报道。

因而利用噬菌体展示的方法寻找已知受体的配基的模拟物,为研制具有独立知识产权的用于疾病治疗的I类生物技术新药是有重要的理论意义和潜在应用价值的。同时由于噬菌体多肽展示文库体内注射后发现了多肽顺序的组织、器官特异性,如分布于鼠脑的氨基酸顺序为CSSRLDAC这种发现为药物走向进入特定靶细胞、靶组织提供了有意义的思路。

随着我国步入老龄社会,神经退行性疾病如老年性痴呆及帕金森氏病等中枢神经系统疾患的治疗意义重大。但在用神经营养因子等治疗中枢神经系统疾患时,由于血脑屏障的存在,除脑室注入的方法外,其他给药途径时多肽药物不能有效地进入脑内。所以如何妥善解决多肽药物的给药途径一直是药物学家的研究重点。血脑屏障是由于脑部血管内皮细胞排列严密及缺少内吞作用而引起的,当然也与药物分子的脂溶性、极性、分子量(不能大于400d-600d)和分子形状等有关。为突破血脑屏障问题,已有大量的工作被报道,如对药物进行化学修饰,制造疏水的同源物以及将有效成分连接到一些特殊的载体如胰岛素受体,转铁蛋白受体上。一次性的打开血脑屏障的方法如颈动脉注射高渗甘露醇或缓激肽(bradykinin)也可使用。P-精蛋白(P-gp)的激活剂和阻扼剂的应用与否有助于提高中枢神经药物在脑中的浓度和减低周围神经药物对中枢神经的副作用。有关研究表明肽核酸(PNA)腹腔注射导致药物在脑内的分布。120K蛋白融合于人艾滋病毒TAT蛋白后导致该蛋白包括脑在内的全身各种组织中的分布。或将多肽连接到OX26单克隆抗体(MAb)上也有利药物在脑内的分布。所有这些方法缺少共隆,也不完善,人们迫切希望有更好的突破血脑屏障方法的产生。我们希望通过噬菌体展示文库工作寻找出另类血管内皮标志多肽分子,它们当中会有已知受体(胰岛素受体,转铁蛋白受体)等的模拟配基顺序和未知的与转运系统   相关的多肽顺序,我们将确定那些具有通透血脑屏障的多肽顺序。

神经生长因子家族是结构和功能相关的一类多肽激素的总称,包括NGF、BDNF、NT&0;3、NT-4、NT-5、NT-6、NT-7。它们在感觉神经元,交感神经元和运动神经元的增殖、分化、成活及凋亡等生理生化过程中起着重要作用,它们的临床应用都受到血脑屏障的限制。所有的这些成员与两类受体作用,他们是神经生长因子的低亲和力受体p75(p 75NGFR、p75NTR)和可高亲和力结合不同神经营养因子的Trk受体家族。p 75可和所有的神经生长因子家族成员结台,能促进trk对相应神经生长因子成员的结合,有关实验表明应用p 75抗体可以阻断由于脊髓损伤所致的疼痛,同时其抗体及NGF、NT-3等可抑制有关神经的凋亡。因此利用噬菌体展示文库分离出p 75受体的多肽面己基,进而结合血脑屏障通透多肽顺序的确定,最终寻找出既有神经生长因子功能又能穿越血脑屏障的基因工程新药无疑是社会所需求的,而这些也正是我们目前正从事的研究。

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