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胶体金标记蛋白质的纯化

标签: 胶体金 标记蛋白质 纯化

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标记好的免疫金探针必须经过纯化处理才能用于IHC染色,尤其是免疫电镜的染色。纯化的目的就是除去其中未标记的蛋白质,未充分标记的胶体金及在标记过程可能形成的各种聚合物。其纯化方法有超速离心法、色谱柱法以及以上二者相结合应用。

(一)超迷离心法

根据胶体金颗粒大小不同及蛋白质种类不同,离心的转速和时间也不同。用牛血清白蛋白稳定的胶体金标记羊抗兔IgG,可先从低速离心(20nm颗粒用250g;5nm用4800g20min),弃去聚集的金颗粒所形成的沉淀,然后将上清液5nm金标记物用60000g于4℃离心1h,20nm和40nm金标记物用14000g于4℃离心1h.小心地吸出上清,将管底沉淀再用1%牛血清白蛋白缓冲液混悬至原量,平衡过夜后,重复离心2次,最后一次洗涤离心的沉淀,再用1%牛血清白蛋白缓冲液(含0.02mol/LNaN3)稀释到l:20.40nm金颗粒在520nm检验吸光度为0.35;20nm金颗粒为0.30;5nm金颗粒为0.25,用1%牛血清白蛋白缓冲液作空白。制备的胶体金-蛋白探针可保存于4℃,如加入50%甘油可贮于0℃以下(-18℃)1年以上。

以聚乙二醇稳定的葡萄球菌A蛋白标记胶体金,按胶体金制备方法及所得颗粒大小不同,用不同离心转速分离纯化,以白磷还原法制备的5.0nm胶体金A蛋白,用125000×g离心;抗坏血酸法制备的11.3nm胶体金-A蛋白,用150000g离心45min,可见离心管底部附贴有小片紧密的沉淀,其上为较疏松的红色沉积物,再上为透明的上清液。附贴管底的沉淀无用,以后操作步骤中不要搅起来,仍保持其贴于管底。弃去上清液后,用等体积的0.0lmol/LPBS(pH7.2)溶解疏松红色沉积物,同上重复离心1次,小心移去上清液,剩余0.5ml上清液,将疏松红色沉积物溶解后,即为初步提纯的金标-A蛋白试剂。

(二)凝胶过滤法

凝胶过滤法必须以BSA为稳定剂。将前述胶体金-蛋白质复合物装入透析袋内,置硅胶中浓缩至原体积1/10左右,用蒸馏水冲洗软化透析袋后,取出浓缩液,以15000r/min离心15min(或用上述离心法纯化后的胶体金,再进一步用此方法纯化)。吸取上清液加到丙烯葡聚糖S-400(SephacrylS-400,Pharmacia公司产品,Sweden)色谱柱上分离纯化。柱床高20cm,直径0.8cm,加样体积为柱床体积的1/10.用0.02mol/LTBS液(内含0.1%BSA,0.05mol/LNaN3,pH8.2者用于胶体金标记IgG,pH7.0者用于胶体金标记蛋白A)洗脱,流速为8ml/h,按红色深浅分管收集洗脱液。可见先滤出的液体呈微黄色,有时略浊,内含大颗粒聚合物等杂质。纯化的金标记蛋白滤出液随浓度增加而红色逐渐加深,清亮透明,此后为略呈黄色的未标记蛋白组分。表中列出胶体金与蛋白质结合后,用离心法纯化的条件。表6-8列出几种免疫金探针离心纯化的条件,仅供参考。

超迷离心转速与金颗粒直径的关系

颗粒直径/nm 离心力/g  颗粒直径/nm 离心力/g
 2-3  125000 10415 64000
445 120000 15~20 14000
648 100000    

几种免疫金探针离心纯化条件

胶体金颗粒/nm  pH  标记蛋白质 离心力/g 时间/min
5 9.0 羊抗人IgG   45000 45 
10 8.2 McAb 45000 30
15 6.5 链霉亲和素 120000  45 
20 6.0 SPA 120000  30
10 9.0 羊抗兔IgG 120000  60

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