摘要：目的 建立快速测定抗子宫内膜抗体（EMAb）的新方法。方法 采用经Sepharose4B免疫吸附柱亲和层析纯化的人子宫内膜抗原（EMAg），以胶体金颗粒结合的羊抗人IgG为标记抗体，根据免疫胶体金技术原理，建立斑点免疫渗滤法（DIGFA）检测人血清EMAb.共检测500份不孕者血清并与酶联免疫吸附试验（ELISA）作对比研究。结果 纯化的人子宫内膜抗原与患者血清中特异性EMAb通过渗滤在硝酸纤维素膜上反应，6 min内即可直接观察结果。在500份血清检测中，阳性率为41.2%，与ELISA的结果基本一致（X2=3.66,P>0.05），符合率96.1%。特异性为95.4%，敏感性为96.3%。交叉试验与重复试验结果显示DIGFA具有较好的特异性及稳定性。结论 DIGFA可快速测定EMAb，具有推广使用的价值。

关键词：斑点金免疫渗滤试验；酶联免疫吸附试验；抗子宫内膜抗体

子宫内膜异位症（EMT）是育龄妇女的常见疾病，也是引起不孕的重要原因之一。发病年龄多在30～40y；发病率占一般人群的1% ～7%，占不孕妇女的30%～40%。在众多不明原因的不孕症患者中，抗子宫内膜抗体（EMAb）检出率达74%，可用于EMT及原因不明的不孕症的辅助诊断，特别适用于亚临床的EMT所致不孕症的辅助诊断。酶联免疫吸附试验（ELISA）被广泛应用来检测EMAb.此类方法虽具有较好的灵敏度及特异性，但操作敏锁，费时费力。因此笔者采用纯化的人子宫内膜抗原（GMAg），以硝酸纤维膜为固相载体，用胶体金标记羊抗人IgG，根据免疫渗滤原理，建立检测血清EMAb的斑点金免疫渗滤法（DIGFA），经与ELISA法比较，结果令人满意，报告如下：

一、材料与方法

1、EMAg的制备和纯化 剖下手术切除的育龄妇女分泌期子宫内膜，剪碎，与2.5g/L胶原酶共育，37℃2.5h后用250μm、40μm不锈钢筛依次过筛，用PBS洗净后收集筛网上子宫内膜腺体，玻璃匀浆器匀浆后，4℃电磁搅拌1h，高速离心30min弃沉淀，上清液用抗人血清抗体Sepharose4B免疫吸附柱除去人血清成分，双缩脲法定量蛋白质为22.6g/L，10倍稀释后低温箱保存备用。

2、材料 金标记羊抗人IgG由卫生部上海生物制品研究所提供，胶体金颗粒购自华美生物工程公司。硝酸纤维素膜购自上海生物医学公司。血清标本来源：河南省南阳市中心医院及南阳市计划生育指导站共500份，年龄23～44y.对照血清30份来自男性健康自愿者，其中抗核抗体阳性血清样本10份，类风湿因子阳性5份。抗精子抗体阳性血清40份均来自南阳市中心医院。

3、DIGFA法的建立 取1μl纯化的子宫内膜抗原（EMAg）液滴加在硝酸纤维膜中央，其下方加健康成人血清IgG（2g/L）0.5μl作为质控线，4℃放置2h，37℃恒温箱内烘干，冷藏备用。测定：在圆孔膜上滴加封闭液100μl，待渗入；滴加未稀释血清标本50μl，渗入完全后加金标羊抗人IgG 50μl，待渗入，加PBS 100μl，置37℃温箱6 min内观察结果。在膜中央出现红色斑点者为阳性，不显色者为阴性，颜色稍浅者为可疑，其下方质量控制线呈红色。

4、ELISA法 抗子宫内膜抗体ELISA法试剂盒购自华美生物工程公司，严格按说明书操作。

二、结果

1、DIGFA结果 用本法测定不孕者血清500例，阳性率为41.2%（206/500）。对照血清30份均为阴性。

2、吸收试验 将纯化的EMAg与ELISA检出的EMAb阳性血清20份等体积混合后用DIGFA检测EMAb，结果均为阴性。

3、交叉试验 将抗核抗体阳性血清10份，5份类风湿因子阳性及40份抗精子抗体阳性血清标本分别进行DIGFA检测，未出现EMAb阳性。

4、对比试验 用DIGFA与ELISA法同时测定不孕妇女500例血清标本，并与ELISA法相比，敏感性为96.3%，特异性为95.4%，符合率96.1%，两法比较无显著性差异（X2=3.66，P>0.05）。

5、重复试验与稳定性检测 取ELISA法检测出的阳性血清和阴性血清各4份，用DIGFA重复检测10次，结果均一致，将点样后的膜与金标抗体置冰箱冷藏，间隔15d测定1次，共测12次，结果无改变。说明DIGFA所用纤维素膜和金标抗体在0～4℃至少可以保存半年。

三、讨论

许多证据表明，子宫内膜异位症是一种自身免疫性疾病，异位的子宫内膜可刺激周围组织产生炎症反应，激活免疫细胞，诱发自身免疫反应，产生EMAb.EMAb的产生与机体免疫应答的紊乱密切相关，可与EMAg形成免疫复合物沉积于子宫内膜和异位病灶中，通过激活补体引起子宫内膜免疫病理损伤，参与子宫内膜异位症的发病，使子宫内膜呈现分泌不足，不利于孕卵着床，导致不孕或反复流产。EMAb检测是目前诊断EMT及不明原因不孕症的重要手段，以往采用ELISA法操作繁锁，需时长，不利于及时诊断治疗。DIGFA是采用金标记物、固相载体和免疫渗滤技术相结合的一种新的检测方法，使整个检测过程仅需数分钟，即可直接观察结果，同时，在金标记IgG向膜下方渗滤时，未与硝酸纤维素膜上已固化抗原结合的血清抗体被冲洗，不能与已封闭的膜结合而渗入膜下，避免了非特异性显色。本研究中DIGFA法与ELISA法相比表明：DIGFA具有较高敏感性、特异性和符合率，且重复性好，试剂稳定，不需特殊设备，简化了繁锁的操作过程，同时也减少了因操作引起的误差。方便实用，便于普及推广。

摘自《现代检验医学杂志》2003年第6期