白细胞介素-2（interleukin rhlL-2，IL-2）主要由活化的T淋巴细胞分泌的一种糖蛋白，是调节机体免疫功能最主要的淋巴因子之一。天然IL-2含有糖基，基因重组IL-2不含糖基，由133个氨基酸组成，相对分子质量为15KD。IL-2在机体应答，免疫调节和抗肿瘤免疫中具有十分重要的作用。临床用于多种恶性实体肿瘤。重组人IL-2是一种重组人白细胞介素-2的生物制品，一般制备成粉针剂应用，其规格以活性单位而不是以重量单位标示。本研究拟通过双抗体放射免疫分析法又称为免疫沉淀法测定注射用粉针剂中重组人白细胞介素-2的重量百分含量。为研制细胞因子的长效制剂或靶向制剂提供新的快捷实用的检测方法。

一、仪器和试药

SN一695B智能放射免疫7测量仪（上海原子核研究所日环仪器厂）；

白细胞介素一2放射免疫试剂盒（天津九鼎医学生物工程有限公司）；

液相试剂盒包括：

（1）标准品6瓶，浓度为0.0，1.2，3.0，9.0，27.0，81.0微克/L，质控血清2瓶；

（2）标记1瓶，总放射性强度小于4uCi；

（3）抗体1瓶；

（4）第二抗体1瓶；重组人IL-2冻干粉针（北京某生物制药有限公司，5O万U/瓶，批号20031972）；注射用水（自制）。

二、方法与结果

（一）标准曲线的制备

在液相试剂盒中精密吸取各浓度（0.0，1.2，3.0，9.0，27.0，81.0微克/升）的标准品200L置5 mL离心管中，每种浓度各设2管。另设T管（总计数管）和NSB管（非特异性结合管）。其余的按浓度依次编号1～6号，每一编号平行做2支。向T管加人100 L的标记抗原，NSB管加人100 L标记抗原和100 L注射用水，其余各管分别加人标记抗原100微升和抗体100微升充分混匀后，置4℃温箱中温育。24 h后取出，向1～6号管中加人分离剂500L，充分混匀，T管中不加分离剂。在室温下静置15min，再放人离心机中离心（3600 r/min）20 min后弃上清液，测定沉淀物放射性强度计数cpm （取其两支平行管的均值，以B表示）。根据B/B。算出2～6管的B/B。值。以各标准管的logit B/B。值为纵轴，标准物浓度（微克/升）的自然对数值（lnC）为横轴，线性回归得方程：Y=-1.035X+2.571，r=0.998 0。表明在0~150微克/L浓度范围内线性关系良好。

（二）标准曲线的检验

将质控QCI、QCⅡ按标准品的加样方式加人标记抗原、抗体和第二抗体，同条件下测出其放射性强度计数B。并求出B/B。值代人标准曲线得质控浓度C。得QCI测=3.68微克/升；QCⅡ测=28.70微克/升，而质控IL-2的浓度范围QCI为2.13～4.07微克/升，QCⅡ为21.92～30.68微克/升。以上质控样品值均在质控范围内，表明该标准曲线合乎要求。

（三）回收率试验

取27微克/升的标准品溶液100 mL与稀释20倍的样品溶液（约28微克/升）100 mL混匀，照样品测定项下测定浓度，计算回收率，得平均回收率为95.71，RSD为5.52（n=5）。

（四）精密度试验

按样品测定项下方法在一日内测定样品与不同日测定样品。结果平均浓度为55.198微克/升，日间RSD为2.28%，日内RSD为5.25 %（n=5）。

（五）冻干粉针剂中rhIL-2的含量测定

精密称取重组人IL-2冻干粉11.2 mg加1.0 mL注射用水溶解，摇匀。再将溶液稀释10倍。成对设置20支试管并编号1～10号，精密吸取上述溶液各200 L置试管中，然后向各管中加入标记抗原100 L和抗体100 L充分混匀后，置4℃的温箱中温育。24 h后取出加入分离剂500 L充分混匀，在室温下静置15min，再放人离心机中离b（3 600 r/min）20min后弃上清液，测沉淀物放射性强度计数B（取其两支平行管的均值）。计算出各管的B/Bo代人标准方程得各管的浓度。见表1。根据以上结果计算得此注射用粉针剂中rhIL-2的含量以重量百分比表示为5.0 （mg/mg），亦即50微克/毫克（注射用粉针剂中每1 mg固形物含50微克rhIL-2）。

三、讨论

天然的IL-2是一种糖蛋白，重组IL-2不含糖基，结构的改变不影响放射性测定法的精密度和准确性。

白细胞介素一2试剂盒中标准品为重组白细胞介素-2，用于体内或细胞培养中自细胞介素-2的测定。现用于制剂中的重组白细胞介素一2的测定，结果证明是可行的。RIA是一种具有高灵敏度、精确度和特异性的体外超微量分析法，技术要求高，影响因素较多。本实验样品结果值的相对标准偏差在理论误差范围内。非特异性结合率（NSB/T）4.28%，试剂盒的重复性和精密度不很理想可以影响相标准偏差的结果[1]。重组人IL-2粉针剂以活性单位标示剂量，而不是以重量单位mg或g表示。改用双抗体放射免疫分析法可直接测得重组人IL-2的重量百分比（以微克/毫克固形物表示）。此方法的建立可为发展新的制剂如细胞因子的长效制剂靶向制剂提供方便快捷的检测手段。

参考文献：

[1] 张占全，郭莹．人白细胞介素一2国家标准品的制备及其特性研究[J]．中国肿瘤生物治疗杂志，1998，5（4）：269~273．