第一天：ELISPOT包被程序，提供两种方案供选择（严格注意无菌操作）

一、传统酒精预湿包被程序

该方案中，需经过：70%乙醇预湿PVDF膜、无菌去离子水洗涤去除乙醇、拍干，最后，加入已稀释好的包被抗体到各实验孔完成包被操作。

具体操作如下：

1、实验卡片填写：设计好试验，把每个孔要加入的内容做成卡片，到时候就会从容很多。

2、每孔加入15μL 70%的乙醇预湿。

注意：

（1）未润湿PVDF膜是洁白、不透明的，经乙醇润湿后，颜色变暗，呈半透明状，很容易观察二者的区别。

（2）加乙醇时，枪头应该靠在孔壁接近孔底的地方，注意枪头不要刺到PVDF膜。

（3）若加入的乙醇挂在孔壁上，盖上板盖，轻轻叩击，让乙醇顺势滑落。乙醇一旦接触到PVDF膜，就会在表面张力和毛细作用之下迅速浸润整块膜，使得膜的颜色和透明度发生变化。

（4）15μL是经过优化的体积，能保证刚好完全浸润整块膜，而不会有剩余。请勿随意加大用量！

（5）膜在润湿后如果不做处理，大约10min后由于乙醇的挥发会重新变干。所以应该在膜变干之前加入去离子水，两步的时间间隔不要超过5min。否则，膜需要重新润湿。

3、洗涤：100μL/孔加入去离子水，洗涤2次。

（1）本次洗涤目的在于：除去预湿用的乙醇。因此应该尽量洗涤干净，减少残留。

（2）包被：按说明书操作。50μL/孔加入用1×PBS稀释好的包被抗体，4°C包被过夜。

5、 封闭：（次日）倾倒包被液，用无菌1×PBS洗涤3次。最后一次，在灭菌的吸水纸上扣干。200μL/孔加入稀释好的封闭液，37°C封闭1h。

6、倾倒封闭液，无须洗涤，直接加入检测细胞进行ELISPOT检测。

二、Magi™ Coating Buffer润湿包被程序

该方案中，用Magi™ Coating Buffer润湿PVDF孔后，直接加入用1×PBS稀释的包被抗体，即可完成抗体的包被。

1、实验卡片填写：设计好试验，把每个孔要加入的内容做成卡片，到时候就会从容很多。

2、每孔加入15μLMagi™ Coating Buffer预湿。

注意：

（1）未润湿PVDF膜是洁白、不透明的，经Magi™ Coating Buffer润湿后，颜色变亮，呈半透明状，很容易观察二者的区别。

（2）加Magi™ Coating Buffer时，枪头应该靠在孔壁接近孔底的地方，注意枪头不要刺到PVDF膜。

（3）若加入的Magi™ Coating Buffer挂在孔壁上，盖上板盖，轻轻叩击，让Magi™ Coating Buffer顺势滑落。Magi™ Coating Buffer一旦接触到PVDF膜，就会在表面张力和毛细作用之下迅速浸润整块膜，使得膜的颜色和透明度发生变化。

3、包被：润湿之后，无须洗涤。每孔加入50μL PBS稀释好的包被抗体，4°C包被过夜。

4、封闭：（次日）倾倒包被液，用PBS洗涤3次。最后一次，在灭菌的吸水纸上扣干。200μL/孔加入用1×PBS稀释好的封闭液，37°C封闭1h。

5、倾倒封闭液，无须洗涤，直接加入检测细胞进行ELISPOT检测。

第二天：接种细胞，加入刺激物，培养（严格注意无菌操作）

整个实验设置1组正对照（PHA刺激），每一个细胞样品（同一个捐献者或实验动物）要设1组负对照（不加刺激物），整块板还要加1组背景负对照（不含细胞，只加培养基和所有检测试剂）。

1、 填好实验卡片，用以指导实验安排及细胞和试剂的添加。每一个细胞/刺激物的组合设复孔（建议2-4孔，客户可根据实验要求自行调整复孔数目）。

2、取出封闭好的板，准备加入细胞。如果是以前做的封闭，先加入200μL的Lympho-Spot™无血清培养基室温静置10min，然后倾倒。

3、细胞上板：按照实验卡片的安排，接种不同浓度的细胞，100μL/well，细胞在孔中的分布要尽量均匀（要诀是加入细胞之后，不要再震动或者拍击ELISPOT板。有人认为拍击板子会让细胞更分散，实际情况刚好相反）。

(1)正对照：细胞浓度为1×104 cells/well。

(2)细胞样品：样品细胞浓度请实验者自行摸索调整，通常为1～5×105cells/well。

(3)背景负对照：加入100μL的Lympho-Spot™无血清培养基，该孔即为背景负对照孔。

4、刺激物：特异性刺激物和非特异性刺激物之分。

5、正对照孔加入10μL PHA，终浓度1-4ug/mL，该浓度能有效刺激IFN-γ的分泌。

6、加入实验者自己的刺激物（用Lympho-Spot™无血清培养基配制成10×终浓度，10μL/well）到实验孔。加完刺激物后不要再拍击ELISPOT板。有人认为拍击板子会让刺激物在孔中混合均匀。实际上，通过扩散，刺激物会很快混合均匀。拍击板子会让细胞聚集分布在孔的外周。

7、加完所有的样品之后，盖上板盖，放入二氧化碳培养箱，37°C培养18-24h。

注意：

碰撞会引起细胞移位，造成斑点模糊、拖尾。在整个培养过程中应避免移动、碰撞培养板，并尽量减少开关培养箱的次数。

第三天：培养后操作（不再需要无菌操作）

1、裂解细胞

倾倒孔内的细胞及培养基，200μL/孔加入冰冷的去离子水，4C冰浴10min（低渗法裂解细胞）。

2、洗涤

每孔加入200μLPBST，浸泡3-5mins后扣出洗涤液，重复5次。最后一次，在吸水纸上扣干。

3、加入检测抗体

每孔加入100μL稀释好的生物素标记检测抗体，37°C孵育1h。

4、 洗涤

每孔加入200μLPBST，浸泡3-5mins后扣出洗涤液，重复5次。最后一次，在吸水纸上扣干。

注意：

(1)有实验者认为，洗涤检测抗体和酶标亲和素时，膜的背面也需要清洗。经我们验证，不清洗膜的背面也完全可以得到满意的结果，但是如果清洗，背景会更干净一些。所以，清洗膜的背面为实验的优化步骤，是否略过，由实验者自行决定。

(2)洗涤膜的背面，我们的方法是：在洗涤最后一次时，将去除塑料保护层的PVDF膜板底面浸入盛有干净PBST的浅托盘中，轻轻漂洗几次即可。

(3)一定要将膜背面和塑料保护层上的液体甩干后，再合拢，盖上，不要划伤到膜。

5、加入酶标亲和素

每孔加入100μL稀释好的酶标亲和素，37°C 1小时。

6、洗涤

每孔加入200μLPBST，浸泡3-5mins后扣出洗涤液，重复5次。最后一次，在吸水纸上扣干。

7、 显色

解冻已配好的AEC显色液。每孔加入100μL的显色液，室温静置15-45min（在20 -25°C，显色25min较合适），注意避光。

8、待斑点生长到适合的大小之后，以去离子水洗涤2遍，终止显色过程。将板倒扣在吸水纸上，拍干细小的水珠，之后取下保护层，放在通风的地方，室温静置10-30min，让膜自然晾干。注意不要将板放到烤箱内，防止膜发脆、破裂。

9、 将ELISPOT板置于Biosys Bioreader自动读板仪内，调节好合适的参数，斑点计数，并记录斑点的各种参数，做统计分析。

总结如下：

（预包被可省去前5步 蓝色背景）