1、聚乙二醇沉淀法测定免疫复合物

简要原理 聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）是一种无电荷的线性分子结构的多糖，为乙二醇的聚合物，有较强的脱水作用。其沉淀循环免疫复合物（circulating immune complex，CIC）的原理不太清楚，可能与CIC的分子量增大和构型的改变有关。利用3%-4%的PEG可以选择性的将大分子CIC沉淀下来，将此沉淀定量溶解，用分光光度计可实现对CIC的检测。

试剂与仪器

（1）M硼酸缓冲液 秤取硼砂0.04g、硼酸0.51g，溶解于100ml蒸馏水中，调节PH至8.6；

（2）7%PEG溶液和3.5% PEG溶液 用硼酸缓冲液配制，PEG分子量为6000；

（3）0.1M NaOH溶液；

（4）分光光度计等。

实验步骤

（1）取0.3ml待检血清,加入等量7%PEG溶液,充分混合,置4℃作用2h,3000rpm离心20min,弃去上清；

（2）用3.5% PEG溶液以同样转速和时间离心洗涤两次，得免疫复合物；

（3）将沉淀物溶于3ml 0.1M NaOH溶液中；

（4）用分光光度计测A280nm值；

（5）同法检测100例以上健康人的血清A280nm，确定正常值范围（X+2SD），以大于正常值时判为阳性。

注意事项

（1）如需定量测定可用不同浓度的热聚合人IgG（HAHG）作为参考标准品，绘制标准曲线，推算血清中CIC的浓度；

（2）血清中γ球蛋白增高或脂肪含量过高可导致检测的假阳性；

（3）待检血清一定要保持新鲜，放4℃冰箱不得超过3天，如-20℃保存，时间可延长；

（4）本试验受温度影响较大，包括离心、洗涤时的温度，室温每升高1℃，沉淀物的A280nm值大约下降0.02；

（5）低密度脂蛋白可引起浊度增加，故应空腹采血；

（6）本试验采用3.5%PEG溶液，若用4%的PEG溶液可沉淀较小的CIC，如为2%的PEG溶液，则只能沉淀分子量较大的CIC，如果PEG的浓度超过5%，可使IgM等其他血清蛋白同时沉淀，导致假阳性结果。

参考文献

（1）陶义训.1997.免疫学和免疫学检验.北京：人民卫生出版社，210-217；

（2）杨廷彬，尹学念. 1994. 实用免疫学. 长春：长春出版社，546-547。

注意事项

（1）采用C1q固相法测定免疫复合物，由于包被用的C1q非常不稳定，所以测定的结果稳定性较差；

（2）SLE患者血清中抗C1q抗体能产生假阳性；

（3）尽可能采用新鲜血清标本，或-20℃保存，避免反复冻融。

参考文献

（1）陶义训. 1997.免疫学和免疫学检验.北京：人民卫生出版社，211－219；

（2）杨廷彬，尹学念.1994.实用免疫学.长春：长春出版社，548－552。

3、固相抗C3 ELISA法测定免疫复合物

简要原理 免疫复合物在激活固定补体的过程中会产生灭活的C3b（iC3b），而结合在免疫复合物上的i C3b可以与抗C3抗体结合。利用酶标记的抗免疫球蛋白抗体可以检测免疫复合物的含量。

试剂与仪器 有成套试剂盒出售。

实验步骤

按说明书进行，主要步骤如下：

（1）用含0.01M EDTA的pH7.5的PBS稀释待检血清；

（2）每孔加入100ul的稀释待检血清，设置三个复孔；

（3）用胶带覆盖酶标板，37℃温育30min，然后4℃放置1h，用BBS–吐温洗涤三次；

（4）每孔加入200 ul HRP-抗人IgG；

（5）用胶带覆盖酶标板，37℃温育30min，然后4℃放置30min；

（6）用BBS–吐温洗涤三次。用蒸馏水冲洗两次；

（7）每孔加入200ul底物液，放置暗处10-30min，直至显色；

（8）每孔加入50ul 4M H2（SO4）2终止反应，用酶标仪测A490nm值。

注意事项

（1）试验时需要以正常人血清设置阴性对照；

（2）本试验方法敏感，可达5-10ug/ml；

（3）本试验方法可以检测能够固定补体的免疫复合物（主要是IgM与抗原组成的免疫复合物或IgG1-3与抗原组成的免疫复合物）；

（4）不适当的操作可以造成IgG的非特异性凝集，如血清反复冻融、加热灭活，或不恰当的贮存，均可造成假阳性。

参考文献

Pereira，A.B.，Theofilopoulos，A.N. and Dixon，F.J.1980. Detection and partial characterization of circulating immune complexes   with solid-phase anti-C3.J.Immunol.125：763-770.