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免疫磁性微球研究进展

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免疫磁性分离技术是利用抗原抗体的高度特异性识别作用,使抗体(或抗原)固定于免疫磁性微球(IMMS)表面,形成固相抗体/抗原的复合物,经外磁场作用后,复合物被滞留,磁性微球载抗原/抗体复合物与其他组分分离,从而达到分离目的。由于磁性微球代替其他固相载体用于免疫分离,不仅简单易行,而且特异性高,损失小,还可将免疫分离与富集结合为一体。因此它在医学、生物分离、食品卫生检测、环境检测等诸多领域展现了广阔的研究与应用前景。

一、磁性微球的简介

1、磁性材料

磁性材料多为 Fe、Co 和 Ni等过渡金属特定晶型的氧化物、混合氧化物及其水化物。在众多磁性材料中,可供选择使用的只有少数几种:如 γ-Fe2O3,MeFe2O3(Me=Co、Mn、Ni),Fe3O4,Ni、Co、Fe、Fe-Co 和 Ni-Fe 合金等,其饱和磁化强度依次递增,稳定性却依次递减。目前最常用的磁性材料为Fe3O4磁粉或磁流体(magnetic fluid,或铁磁流体,ferrofluid)。后者是含有超细磁性粒子(粒径10~40nm)的混悬液,在外磁场作用下可在体内定向移动聚集,靶向性较强,并可定期、安全地排出体外。此外,磁流体可吸收交变磁场中电磁波的能量转化为热能,使局部温度升高而杀伤肿瘤组织。

2、磁性微球

磁性微球按组成的材料的不同,可分为无机微球、生物高分子微球、高分子微球等。就目前国内外的研究状况,磁性聚合物微球按结构主要分为 3 大类:A.核-壳结构,即磁性材料为核,聚合物为壳;B. 夹层结构(也称壳-核-壳结构),即内核为聚合物,中间层为磁性材料,外层为聚合物;C. 网状结构,即磁性材料分散于聚合物微球中(图1)。


图1 三种不同结构的磁性聚合物微球

A.核壳结构 B.夹层结构 C.网状结构

磁性材料 聚合物材料

Fig 1 The three structures of magnetic polymer microsperes

magnetic materials polymer materials

A. core-rind structure B. samdwich structure C. reticulation structure

Fe3O4纳米粒子在粒径小于30nm时,具有超顺磁性,即在没有外界磁场作用时,没有磁性;而存在外界磁场作用时,则极易被磁化;外界磁场撤销后,又会在极短的时间内退磁,没有磁滞现象,矫顽力为零。超顺磁性的出现可归因为:在小尺寸下,当各向异性能减小到与热运动能可相比拟时,磁化方向就不再固定在一个易磁化方向作无规律变化,结果导致超顺磁性的出现。

3、聚合材料

常用的聚合物材料有白蛋白、明胶、球蛋白、酶类、聚赖氨酸、聚故氨酸、淀粉、葡聚糖、壳聚糖、阿拉伯胶、果胶、乙基纤维素、聚苯乙烯、聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚醋酸乙烯脂、聚丙烯酸等,这些材料都具有一定的通适性,对人体无毒性。

4、磁性微球必须满足的条件

(1)超强的顺磁性,就是指在磁场的存在下能迅速聚集,离开磁场能够均匀分散,不出现聚集现象;

(2)合适的粒径(粒径小于30nm)且粒径分布单分散,使微球有足够强的磁响应性,又不会因粒径太大而发生沉降;

(3)具有丰富的表面活性基团,以便微球可以和抗体/抗原偶联,并在外磁场的作用下实现分离。

二、磁性微球的制备原理与方法

1、包埋法

包埋法是将磁性粒子分散于高分子聚合物溶液中,通过雾化、絮凝、沉积、蒸发等手段得到磁性聚合物微球。Gupta 等将磁性粒子与牛血清清蛋白和棉籽油进行超声处理,然后加热至 105~150℃,得到外包牛血清白蛋白的磁性微球;一般而言,包埋法得到的磁性微球其磁性粒子(磁核)与外壳层的结合主要通过范德华力(包括氢键)、磁粒表面的金属离子与聚合物链的螯合作用以及磁性粒子表面功能基与聚合物壳层功能基形成的共价键。利用包埋法制备磁性微球方法简单,但所得的粒子粒径分布宽、形状不规、粒径不易控制、壳层中难免混杂一些诸如乳化剂之类杂质,用于免疫测定、细胞分离等领域会受到很大的限制。

2、单体聚合法

单体聚合法是在磁性粒子和单体存在下,加入引发剂、稳定剂等聚合而成的核-壳结构磁性聚合物微球。迄今为止,单体聚合法合成磁性微球的方法主要有:悬浮聚合、乳液聚合(包括无皂乳液聚合、种子聚合)、分散聚合等。单体聚合法成功的关键在于确保单体的聚合反应在磁粒表面顺利进行。一般而言,磁性粒子为亲水性,对于亲水性单体如戊二醛,单体易接近磁性粒子,但对于大多数油性单体如苯乙烯、甲基丙烯酸甲脂等,据核反应则难以在磁粒表面顺利进行。适当改进悬浮聚合的有机相组成,或对磁性粒子进行表面处理,可使单体在磁粒表面顺利聚合。

悬浮聚合法具有微球粒径分布宽、粒径较大、固载量小、并有不含磁性物质空白球的缺点,但作为固定化酶的载体,有利于保持酶的活性,而且磁响应性也较强。目前来说,采用乳液聚合法难以制备出粒径大于 1μm的磁性聚合物微球,而当磁性聚合物微球用于细胞分离、固定化载体领域时,为了能在磁场下快速分离,多希望磁性聚合物微球粒径大于 1μm。

分散聚合法是指一种溶于有机溶剂(或水)的单体,通过聚合生成不溶于该溶剂的聚合物,而且形成胶态稳定分散体系的聚合方式,这对于合成大粒径、单分散性的磁性聚合物微球具有得天独厚的优势,同时,该方法向微球表面引入功能基团很方便。

3、共沉淀法

共沉淀法是指二价与三价铁离子在碱性条件下沉淀生成 Fe3O4 或利用氧化-还原反应生成 Fe3O4 的同时,利用聚合物材料(例如聚乙二醇、葡聚糖等)做分散剂,得到外包聚合物的磁性微球。共沉淀法得到的磁性微球通常粒径较小( 10nm~100nm),因而具有较大比表面积和固载量。但其含磁量低,磁响应性较弱,操作时需要较强的外加磁场[10]。

4、化学沉淀法

化学沉淀法是指将一定浓度的磁性金属阳离子渗透和交换到大孔树脂中去,然后利用化学反应使金属离子转化为磁性金属氧化物,使之均匀分布在聚合物的孔结构中,渗透和转化步骤可反复进行;另一种方法是将树脂硝化,然后在酸的存在下,用硝酸将金属(如铁)氧化成金属氧化物,但这样得到的磁性微球仅限于树脂表面。

该方法操作简便,树脂中磁性分布均匀,磁含量容易控制,但对树脂的要求比较严格。例如用一定比例的二价和三价铁离子溶液浸泡阳离子交换树脂,然后将树脂置于碱性溶液中,使铁离子转化为Fe3O4,这两步操作可以反复进行。

三、免疫磁性微球的应用

1、医学方面应用

免疫磁性微球作为靶向释药系统的载体,在外加磁场的作用下,将药物载至预定区域,可使免疫磁性微球上的抗癌药物更易与癌细胞接触,提高了杀伤癌细胞的效果。Kharkevich 等将具有磁性的可溶性聚电解质与含神经肌肉麻醉剂的脂质体的磁性药物载体,用于猫体实验,取得了良好的效果。通过免疫磁性微球(IMMS)体外净化骨髓已经广泛的应用于高剂量化疗后的自体骨髓移植,取得了令人鼓舞的结果。至今已经应用于几乎所有的需要进行骨髓净化的癌症类型[12]。如神经母细胞、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、小细胞癌、乳腺癌等。

2、生物分离方面应用

免疫磁性微球分离方式有两种:直接法,即用抗体包被磁性粒子,再与抗原结合形成复合物,在磁场中与其它物质分离;间接法,就是先用第二抗体包被磁珠,使磁珠成为第二抗体的载体,抗原与第一抗体结合后再加入带有第二抗体的磁珠,磁珠上的第二抗体便与第一抗体结合,形成复合物,在磁场中该复合物得到分离。

免疫磁性微球技术可用来分离人类各种细胞,如红细胞、外周血嗜酸/碱性粒细胞,神经干细胞,造血细胞、T淋巴细胞及多种肿瘤细胞等。在骨髓移植(BMT)的临床实践中,曾采用免疫磁性微球去除自体骨髓移植物中残存癌细胞以降低白血病复发的机会,同样的方法用于选择性去除异体骨髓移植物中T细胞以防治移植抗宿主病(GVHD)的发生。免疫磁性微球在细胞分离方面还广泛应用于:分离纯化特定细胞,进行生理病理研究;用于白血病、艾滋病的治疗;造血干细胞的分离纯化以及遗传病和肿瘤的基因治疗等等。

此外,Nakamura 等把细菌磁微球用于分离血清中免疫球蛋白 IgG 的含量。 Fabregas 等将 IMMS 用磁场固定在一个平板换能器上,制得一种新型免疫传感器,并将其应用于流动分析系统,能够分离出样品中微摩尔级浓度的兔抗 IgG。

3、食品卫生检测方面应用

免疫磁性分离技术不但广泛应用于医学、生物学的各个领域,而且在食品卫生检测方面的应用也初见端倪。沙门氏菌是引起食物中毒最常见的菌属之一。Skjerve 等报道了用免疫磁性分离技术从乳及乳制品、肉类和蔬菜中分离出沙门氏菌,其检测限为每克 1×102 个细菌。Seo 等将 FIA 与免疫磁性分离结合,测定接种于牛肉、苹果汁和生牛奶中的低浓度大肠杆菌,每克牛肉中仅有 4 个大肠杆菌即可被检出。可见将免疫磁性分离技术和其它检验方法,如酶联免疫吸附分析(ELISA),多聚酶链式反应(PCR),荧光免疫分析(FIA),电子化学发光(ECL)相结合,可以数倍地提高分离效率和检测极限。

4、环境检测方面应用

目前已经尝试将 IMMS 引入环境监测领域,用于对环境中自然水体、工业废水、生活污水、土壤环境中部分有毒有机物、病毒、细菌的检测。Yu. H成功地将 IMMS 应用于快速分离食品及环境水体中的细菌和毒素,并将这种分离技术和荧光免疫分析法相结合,能够快速探测出环境水体中 2×10-3 个/mL 的 E. coli O157,并能够完成 96 个/h样品的检测。Sylvie 等研究用 IMMS 富集环境水体中的似隐菌属担孢子(一种能够引起肠胃疾病的原生动物),然后采用 PCR 扩增检测技术进行检测,其检测灵敏度达到能够从每 100L水中检出 1 个卵囊的水平。Lawruk 等用磁性微球酶联免疫吸附法测定环境水样及土壤中氰基丫嗪,同时选用 IMMS 作为 2,4-D 抗体固相,检测环境水样中的 2,4-D 及其酯类,该法灵敏度更高,检出限可达 0.7μg/L。

四、小结

免疫磁性微球是免疫学与磁性微球技术结合的一类新型材料,其分离技术由于具有简便、快速。分离纯度高等优点已被广泛用于各个领域。随着免疫磁性分离技术的发展,必将使IMMS应用到更加广泛的领域。目前使用IMMS技术本身已日趋成熟,以后研究方向将围绕以下问题。

1、磁响应性与粒径的关系

磁性微球的突出特点是其在外加磁场的作用下定向移动。未来磁性制备的目标是获得高磁响应性、高比表面积、低密度、单分散的微球,或者寻求新的磁性材料作为磁核以及对磁核的特殊处理能有助于解决这一问题。

2、特定的抗原-抗体结合物

对于特定的抗原/抗体的快速分离与检测,找到对应的、具有最强亲和力的抗体/抗原,使其形成稳定的抗原-抗体复合物,且不影响其空间稳定性及活性将会是未来研究的重点。

3、磁性微球的应用

磁性微球应用应解决的问题是如何避免包覆的高分子层的分解以及磁性微球的再生,增长微球的使用寿命,使其能商业化生产。

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