1、材料与试剂

（1）pH7.2巴比妥缓冲液

配制时，先将巴比妥溶于500ml水中，然后加入氯化钠和巴比妥钠，加水至2000ml，最后加入氯化镁和氯化钙。高压灭菌后，置4℃保存，此为原液。应用时，以蒸馏水作1：5稀释，配成使用液，并测定使用液的pH值。如pH值过高则以巴比妥调节，过低则以巴比妥钠调节；

（2）1％琼脂糖 以0.10%叠氮钠防腐；

（3）绵羊红细胞；

（4）溶血素 要求效价在1.0×10⁴倍以上；

（5）乙脑病毒P3株 其对小白鼠（8g～10g体重）的MLD（脑内）为1.00×10-9/0.03ml；

（6）抗乙脑病毒抗体 是采用地鼠肾细胞培养的乙脑病毒物多次腹腔接种豚鼠而获得，补体结合反应效价达256×以上为合格。应用前，需加入1/10量的新鲜补体液，37℃水浴感作1h，然后56℃感作30min以灭活补体。此过程是除去豚鼠血清中的抗补体成分；

（7）正常豚鼠血清；

（8）塑料琼脂扩散板 板长7.20cm，宽2.50cm，高0.20cm。

2、操作方法

（1）绵羊细胞的致敏 取效价1.00×10⁴倍以上的溶血素，以pH7.2的巴比妥缓冲液做100倍稀释，同时加入已洗涤好的绵羊红细胞泥，配制成40%左右（V/V）的红血球，充分混合后，置37℃水浴感作30min，其间振荡2～3次。然后4℃保存。这种致敏红细胞可在4℃内保持一周有效；

（2）固相致敏血球板的制备 将以上致敏红细胞悬液37℃水浴预热后，吸取0.1ml，加入已融化好并冷却至50℃～55℃的1%琼脂糖（3ml）管中，迅速倾倒混合均匀，并倾入塑料琼脂扩散板中，自然冷却后加盖，4℃保存。此板可保存2周；

（3）敏感试验 每批固相致敏血球板制好后，必须进行敏感性试验。选其中一板，在琼脂上打孔，直径6mm，滴入以生理盐水稀释的3倍的补体（豚鼠血清），盖上盖，放入37℃温箱中1h后取出观察，应出现溶血圈。放置4h后溶血圈的直径达8mm以上者为合格固相致敏板；

（4）打孔 用直径6mm的打孔器在琼脂板上打孔两排，上下排各4个。同时在右上角打一小孔，以作为方位记号；

（5）样品处理 将乙脑感染的鼠脑和健康正常的鼠脑分别用生理盐水于研磨器研磨成均匀的10×稀释的乳剂，以3000r／min离心20min，吸取上层液供检验用；

（6）样品预处理 在小管中滴加等量的（如1～2滴）10×稀释的脑乳剂离心上清液，免疫血清和补体，充分混合，置37℃感作2h～6h。同时用阴性血清同样处理；

（7）加样 每个样品加两个孔，上孔加阴性血清处理的样品，下孔加阳性血清处理的样品，加样必须一致，以加满为度；

（8）扩散 加毕后加盖，置37℃扩散，并随时观察记录结果。

3、结果判定

37℃温箱感作1.5h～2h后初判，首先看上排孔，此时都已出现清晰但较窄的溶血圈。随即观察下排孔，有不出现溶血圈者即判为阳性，也出现溶血圈者（可能比上孔的溶血圈稍窄），判定为阴性。如果反应不清晰，可在滴样后4h再作一次终判。此时溶血圈较宽，故可测量同一病料上孔与下孔的溶血圈直径之差。以相差1.5mm以上者为阳性，相差1mm～1.5mm者为可疑，相差1mm及以下者为阴性。溶血圈中溶血不完全时扣0.5mm，例如溶血圈直径为7mm，但溶血不完全，则以6.5mm计算。
当初判与终判结果发生矛盾时，以初判为准。

为便于观察和测量溶血圈，可在致敏血球板下置一白纸，距离20cm左右，判定时由上向下观察。