[器材和试剂] ● PCR试剂和设备 ● cFv基因文库单链模板DNA,制备自pHENl中的天然scFv文库(10ng/u1) ● Gelleclean试剂盒(Qbiogene) ● Wtzard PCR纯化试剂盒(ProlneSa) ● RJHl/2Xho引物: 5'-GGC ACC CTG GTC ACC GTC TCG AGT GGT GGA-3' ● RJH3Xho引物: 5'-GGG ACA ATG GTC ACC GTC TCG AGT GGT GGA-3' ● RJH4/5Xho引物: 5'-GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCG AGT GGT GGA-3' ● RJH6Xho引物: 5'-GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCG AGT GGT GGA-3' ● FdSEQl引物 ● pHENl-Vλ3载体DNA(可以根据 MTA) [方法] 1. 配制4个独立的50ul PCR反应混合液, 包含: ● 水,35.5ul ● 20XdNTP(每种5mmol/L),2.5ul ● 10XVent聚合酶缓冲液,5.0ul ● FdSEQl引物 (10pmol/u1),2.5ul ● 反向引物(10pmol/u1),2.5ul ● 单链scFv模板DNA(10ng),1.0ul |
● Vent DNA聚合酶(2单位),1.0ul 2. 在有加热盖的热循环仪内加热反应混合液到94℃5分钟。 3. 以94℃30秒、42℃30秒、72℃1分钟的条件共循环25次,扩增VL基因。 4. 用Wizard PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。 5. 用XhoI和NotI消化PCR产物;但除了用XhoI替代 NcoI,还需用NEB2缓冲液和BSA,按照厂家要求进行。 6. 用XhoI和NotI消化pHENl-VL3载体DNA;但不要用XhoI替代NcoI. 7. 连接已消化的PCR产物和已消化的载体,并电转化到大肠杆菌TGl细胞中,构建4个VL基因噬菌体文库。测定文库容量并将细菌性文库材料储存于-70℃。 8. 用含甘油文库储存材料细菌接种到含100ug/ml氨苄青霉素和1%葡萄糖的100ml 2X TY培养基中,制备每种VL基因文库DNA.接种量应足够大以保证接种细菌数至少比文库容量大5倍。过夜培养后,按标准的DNA质粒制备方法进行操作。为了续后进行文库消化,可合并不同文库的DNA. |
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