一、预备试验 1、绵羊红细胞悬浮液的制备 通常用公绵羊红细胞,将绵羊血液采集于带有玻璃珠的无菌容器中,充分振摇,使脱去纤维,此时血液失去凝固性,称脱纤血。亦可用阿氏液保存血液,阿氏液配方如下:
溶液配好后,高压(10磅)灭菌10min,也可通过蔡氏滤器灭菌。溶液盛于瓶内,将绵羊血直接采入瓶内,血量应大致与阿氏液量相等。摇匀,置冰箱中保存,可保存3周左右。 用时将血液移入离心管内,加3~5倍量生理盐水,离心沉淀洗涤三次,每次2000r/min,离心10min,然后去掉上清液,血球泥用生理盐水配成2.50%液应用。 2、溶血素效价测定 溶血素是用绵羊红细胞,经多次免疫家兔,抽取家兔血清,加入甘油而成。在冰箱中可保存二年以上。每隔两、三个月测定效价一次。溶血素可从生物制品厂购买。 溶血素效价测定的方法:先将溶血素稀释成100倍,即0.20ml的溶血素(溶血素实量含0.10ml)加入9.80ml生理盐水混合即可。然后按表1配成稀释液:
另取小反应管一列,按次序从每一稀释液取0.50ml分别加入各管中,添加时应由稀释度大的稀释液加起,这样可不必更换吸管。然后再加入生理盐水1.00ml,1┱20补体和2.50%红细胞悬液各0.50ml。在37℃水浴槽中放20min后判定结果。详细造作程序见表2。
试验中发生全部溶血的溶血素最大稀释倍数(即1┱2000),微溶血素的效价,亦称一个溶血单位。做正式试验时,溶血素按二个单位稀释使用。在本例中,其使用浓度应为1:1000。 |
3、补体的效价测定 取健康豚鼠3只以上,饲喂前,每只从心脏取血8ml~15ml,注入培养皿内,放入37℃温箱内30min,取出置4℃冰箱内,待血清析出后,吸入离心管中,3000r/min离心15min,取上清趁新鲜稀释使用。如一次采取大量补体,可定量(1ml~2ml)分装于青霉素瓶内,置低温冰箱冻结保存。避免反复冻融。也可从兽药厂购买冻干补体,在冰箱内可保存三年。 测定和使用补体时,按表3进行。
补体效价测完后,按表添加各种成分。所用的致敏血球是将2单位溶血素和2.50%红细胞液等量混合后,置37℃水浴中15min,即成为致敏血球。 在2单位溶血素的存在下,能使0.50ml的2.50%红细胞完全溶血的最小补体量,即为该补体的效价。在本例中,补体效价为1:20稀释液0.25ml。 效价测完后,按下列计算原补体在使用时应稀释的倍数。0.50/0.25×20.0=40.00,即此补体应作1:40稀释使用,每管加入0.50ml,此即为1个单位补体。考虑到补体性质不稳定,在操作过程中效价会降低,故此使用浓度比原效价大10.00%左右较为适宜。因此,本批补体应用1┱36稀释使用,每管加入0.50ml。 4、抗原效价测定 鼻疽补体结合反应抗原是用强毒鼻疽杆菌的混悬液,经高压灭菌,并在冷处浸泡取其滤液制成的。鼻疽抗原可向兽药厂购买。使用时按出厂使用说明书或标签标明的效价稀释应用。如因保存时间过久或其它原因,抗原效价可能发生变化,使用前加以滴定。 (1)抗原稀释 用生理盐水将抗原原液作成9种稀释液,方法如表4。 表4 抗原稀释表 (2)血清稀释 取鼻疽强阳性血清和弱阳性血清各一份,用生理盐水按表5做成5种稀释液,在60℃水浴中灭能30min。
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(3)操作法 按表6进行。摆12排反应管,由左向右加入不同稀释度的抗原0.50ml。然后再由上向下,第一排的9个试管各加入1∶10灭能的阴性马血清0.50ml。第二排的9个试管各加入生理盐水0.50ml。第三排至第七排试管分别加入不同稀释度的强阳性血清0.50ml。第八排到第十三排再分别加入不同的稀释度弱阳性血清0.50ml。所有试管加入一个单位补体0.50ml,混匀后置37℃水浴箱20min取出,每管加致敏血球1.00ml,摇匀后,置37℃水浴20min,取出,观察反应结果。
表7是一份强阳性血清测定结果的一个示例。按比例,抗原1┱100稀释液与强阳性血清的各稀释度所发生的抑制溶血现象最强。如果对弱阳性血清的各稀释液的反应亦与此相同,则此批抗原的效价为1┱100,这就是一个抗原工作量。应注意,测定抗原必须用病马阳性血清,不可使用注射鼻疽死菌免疫的兔高免血清。 5、待检血清和对照血清 对照用鼻疽阳、阴性血清可于兽医生物制品厂购买,也可自送检血清中选取。 待检血清采血时,最好在早饲前或在停食后6h,以免血清混浊。采血后,趁血未凝固,将试管斜置,使其凝成斜面。凝固后将试管置于温暖处,使血清析出,经过10余小时,将血清倾入另一干净无菌试管中。如血清析出不良时,可用镍线将血凝块划破,并使之从管壁脱离,放于冷暗处,使血清充分析出。 血清采后最好于1天内送到实验室,最迟不超过3天。若3天内不能送到,应加防腐剂。通常加0.50%石炭酸防腐。试验前,用生理盐水将待检血清稀释10倍,然后在水浴槽内加温灭能30min,马血清加温到60℃。驴、骡血清为63℃~64℃。灭能不但能消除血清中的补体和抗补体作用,且能使它在反应中作用趋于稳定。 二、本试验 预备试验完毕之后,即可进行本实验(参见表8)。 待检血清作1:10稀释,分装两管,各0.50ml。其中一管加抗原,一管不加抗原,作为血清抗补体对照。对照血清用阳、阴性血清各一份。补体加一个单位0.50ml。混合后,置37℃水浴中20min。取出后,所有试管加致敏血球1.00ml,混匀、再于37℃水浴中放20min。取出后,判定结果。 |
符号记载说明: ++++:90%-100%抑制溶血; +++:50%-90%抑制溶血; ++:30%-50%抑制溶血; +:10%-30%抑制溶血; —:0-10%抑制溶血。 试验结果:阳性血清对照管必须100%抑制溶血,方认为正确。观察反应可使试验结束后进行第一次判定,先将阴性血清判定完。其余血清,可放暗处数小时,待红细胞下沉后,再作第二次判定,较为方便。 在马鼻疽,若反应为“++++”或“+++”时,可判为阳性;若为“++”或“+”时判为可疑;若为“-”时判为阴性。 为了判定上的方便,可制出标准溶血管。其制法为:取在本试验中使用的2.50%红细胞混悬液5ml于离心管中,离心沉淀,去上清液,加入20ml蒸馏水,用力振摇,使红细胞完全溶解,再加入5ml 4.50%氯化钠溶液,此为100%溶血液。 取本试验用的2.50%红细胞混悬液5ml,于20ml生理盐水混合,此为100%不溶血的红细胞混悬液。 取11支反应管,其管口粗细应与所用的反应管相一致。按表9加入上述两种成分。
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