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流式细胞术检测样品推荐制备方法

标签: 流式细胞术 检测样品 制备方法

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A. 直接标记抗体(FITC标记抗体):

(1)  收集1×106个细胞,800rpm离心5min,4℃以上冷PBS洗一次。

(2)  用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟,800rpm离心5min去上清。加2ml PBS重悬洗涤细胞,800rpm离心5min。

(3)  用1ml含5% 人血清的 PBS 重悬细胞,冰上孵育10min,800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和饱和剂量的荧光标记抗体(5×105个细胞/20ul抗体)的PBS ,避光冰上放置30min,离心弃上清。 加入200ul 1% 多聚甲醛固定,待测即可。

(4)  用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。

B. 未标记抗体间接免疫荧光标记法:

(1)收集2×106个细胞,用冷的PBS 2ml 洗涤细胞一次,800rpm离心5min。

(2)用2ml 4%多聚甲醛室温固定细胞40min,800rpm离心5min;2ml PBS重悬细胞,800rpm离心5min;

(3)用1ml含0.2%Triton-X100和5%血清的PBS重悬细胞,冰上放置10min,800rpm离心5min。

(4)加入饱和剂量未标记抗体,冰上放置40min,800rpm离心5min,用2ml冷的PBS 重悬细胞,800rpm离心5min,洗去未结合一抗,重复一次。

(5)加入荧光标记(FITC)标记的二抗,冰上避光放置40min后,800rpm离心5min,去上清,PBS洗涤两次。

(6)加入0.5ml 1%多聚甲醛重悬细胞;固定待测。

(7)流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。

C.细胞周期、细胞凋亡及DNA倍体分析样品(PI染色)的制备:

(1)待测样本制成单细胞悬液,然后200g离心5分钟,弃上清。

(2)用4℃预冷的70%冷乙醇固定,4℃保存 ,至少固定18小时。

(3)调整细胞浓度为106细胞/毫升,取1毫升细胞悬液,用PBS洗三次,细胞重悬于1毫升PI染液中,37℃孵育30分钟即可进行流式分析。

(4)PI染液终浓度为50微克/毫升,RNase A终浓度为20微克/毫升。

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