A. 直接标记抗体(FITC标记抗体): (1) 收集1×106个细胞,800rpm离心5min,4℃以上冷PBS洗一次。 (2) 用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟,800rpm离心5min去上清。加2ml PBS重悬洗涤细胞,800rpm离心5min。 (3) 用1ml含5% 人血清的 PBS 重悬细胞,冰上孵育10min,800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和饱和剂量的荧光标记抗体(5×105个细胞/20ul抗体)的PBS ,避光冰上放置30min,离心弃上清。 加入200ul 1% 多聚甲醛固定,待测即可。 (4) 用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。 B. 未标记抗体间接免疫荧光标记法: (1)收集2×106个细胞,用冷的PBS 2ml 洗涤细胞一次,800rpm离心5min。 (2)用2ml 4%多聚甲醛室温固定细胞40min,800rpm离心5min;2ml PBS重悬细胞,800rpm离心5min; (3)用1ml含0.2%Triton-X100和5%血清的PBS重悬细胞,冰上放置10min,800rpm离心5min。 (4)加入饱和剂量未标记抗体,冰上放置40min,800rpm离心5min,用2ml冷的PBS 重悬细胞,800rpm离心5min,洗去未结合一抗,重复一次。 (5)加入荧光标记(FITC)标记的二抗,冰上避光放置40min后,800rpm离心5min,去上清,PBS洗涤两次。 (6)加入0.5ml 1%多聚甲醛重悬细胞;固定待测。 (7)流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。 C.细胞周期、细胞凋亡及DNA倍体分析样品(PI染色)的制备: (1)待测样本制成单细胞悬液,然后200g离心5分钟,弃上清。 (2)用4℃预冷的70%冷乙醇固定,4℃保存 ,至少固定18小时。 (3)调整细胞浓度为106细胞/毫升,取1毫升细胞悬液,用PBS洗三次,细胞重悬于1毫升PI染液中,37℃孵育30分钟即可进行流式分析。 (4)PI染液终浓度为50微克/毫升,RNase A终浓度为20微克/毫升。 |
→如果您认为本词条还有待完善,请 编辑词条
上一篇时间分辨荧光免疫定量分析简介 下一篇ROS流式检测Q&A
词条内容仅供参考,如果您需要解决具体问题
(尤其在法律、医学等领域),建议您咨询相关领域专业人士。
3